髁突軟骨誘導外源性骨髓間充質干細胞成軟骨分化的實驗研究

張趙一淳 鹿蕾 于世賓 楊鴻旭 葉濤 馮劍穎

顳下頜關節(temporomandibular joint，TMJ)骨關節炎(osteoarthritis，OA)的典型病變為軟骨退變和軟骨下骨異常改建[1]。OA的干細胞治療是目前的研究熱點。臨床研究顯示給OA患者關節腔注射間充質干細胞可改善其臨床癥狀[2-3]。動物實驗顯示關節腔注射間充質干細胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)可明顯抑制關節退變，且關節內注射的MSCs可在關節中定植，并表達軟骨標記物-II型膠原[2]。課題組前期的研究也表明，顳下頜關節局部注射的骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)可定向遷移和定植于病變髁突，并向軟骨細胞分化[3]。但目前，病變髁突與正常髁突誘導BMSCs成軟骨能力的差別及其機制還未見報道。c-myc和ERK1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)在干細胞的成軟骨分化中起著重要作用[4-7]，在髁突誘導BMSCs成軟骨分化的效果有待研究。

本實驗旨在研究正常和OA髁突軟骨誘導外源性BMSCs成軟骨分化能力的差別，及髁突軟骨對BMSCs的c-myc和ERK1/2表達的影響。

1 材料與方法

1.1 軟骨組織和BMSCs

8 周齡C57BL/6雌性小鼠(購自第四軍醫大學實驗動物中心)隨機分為實驗組和操作對照組(各13 只)。分組情況見表 1。實驗組建立單側前牙反(unilateral anterior crossbite， UAC)誘導的小鼠TMJ OA模型[8]， 12 周后， 一部分(每組3 只)取雙側TMJ局部組織，用于組織學染色，另一部分(10 只)取雙側TMJ髁突軟骨組織塊，用于Transwell共培養。對照組操作流程同UAC組，只是最終不粘接不良修復體(表 1)。BMSCs為細胞系：C57BL/6的BMSCs(MUBMX-01001，Cyagen公司，美國)。

表 1 實驗動物分組

1.2 組織學染色

HE染色：采用常規HE染色流程，封片后顯微鏡下觀察。測量軟骨厚度[8]。

甲苯胺藍染色：細胞爬片在甲苯胺藍染液中浸泡5 min，流水沖洗5 min，冰醋酸分化20～30 s，流水沖洗5 min，風干后浸泡二甲苯兩次， 5 min/次，封片，顯微鏡下觀察。

番紅O染色：烤箱中預熱30 min，脫蠟， 0.02%固綠染液中浸泡5 min， 1%冰醋酸中漂洗1 min， 0.1%番紅O 染液中浸泡5 min， 95%酒精浸洗1～2 min，風干后浸泡在二甲苯中2 次， 5 min/次，封片，顯微鏡下觀察。測量番紅O染色積分光密度[3]。

1.3 Transwell共培養

在纖連蛋白包被的Transwell小室中(4 μm微孔濾膜，Corning，USA)，上室接種髁突軟骨組織塊，下室接種3～5 代的BMSCs，孵育48 h后，制取BMSCs細胞爬片，或刮取BMSCs用于提取mRNA。

1.4 免疫熒光染色

烤箱中預熱切片30 min，脫蠟。復合消化液孵育10 min，PBS蕩洗3×5 min，抗原修復液孵育10 min，PBS蕩洗3×5 min， 2%羊血清封閉30 min，滴加一抗， 4 ℃中孵育過夜，次日室溫復溫30 min，避光滴加熒光二抗， 37 ℃中孵育30 min， 避光滴加1∶800的DAPI， 37 ℃中孵育10 min，防淬滅封片劑封片，共聚焦顯微鏡下觀察。所用一抗包括： c-myc (1∶100， ab32072)、 ERK1/2(1∶100， ab17942，Abcam公司，英國)。

1.5 RNA的提取

搗碎髁突軟骨組織，與Trizol裂解液輕輕混勻后冰上靜置20 min，加入20 μl氯仿，震蕩15 s，室溫靜置10 min。 12 000 g離心15 min，液體分下層有機相、中間相和上層水相。小心吸取上層水相至另一EP管，加入50 μl異丙醇，混勻，靜置20 min， 12 000 g離心15 min，RNA沉淀至管底，棄去上清，加入75%乙醇洗滌RNA， 7 500 g離心10 min，棄去酒精，將EP管倒置于濾紙上使RNA干燥。加入20～30 μl DEPC水使RNA溶解，測定RNA的濃度和A值。

1.6 Realtime-PCR反應

將RNA反轉錄后在Applied Biosystem 7500 Realtime-PCR儀中(ABI公司，美國)用兩步法的擴增程序進行PCR反應，記錄目的基因相對于GAPDH的量，將對照組設定為1，記錄UAC實驗組目的基因相對于對照組的值。每個實驗重復反應3次， 3次反應的平均值用于統計分析。所用的Col2a1引物為以往報道過的序列[7]：5′-CATCCAGGGCTCCAATGATGTA-3′ 和5′-ATGTCCATGGGTGCGATGTC-3′。

1.7 統計分析

2 結 果

2.1 UAC致顳下頜關節骨關節炎

HE染色結果顯示：對照組髁突軟骨厚度正常，軟骨細胞排列規則；UAC組髁突軟骨變薄，軟骨細胞排列不規則，出現裂隙。軟骨厚度統計結果顯示UAC組軟厚度較對照組明顯變薄(P<0.05)。番紅O染色結果顯示：對照組髁突軟骨軟骨基質染色均勻；UAC組軟骨基質分布不均勻。UAC組番紅O積分光密度較對照組顯著減少(P<0.05)(圖 1)。

2.2 2 組BMSCs成軟骨分化能力的差異

A: HE對照組; B: HE UAC組; C: 番紅O對照組; D: 番紅O UAC組; E: 番紅O染色統計分析; F: 軟骨厚度統計分析

圖1 對照組及UAC組髁突HE和番紅O染色結果(×200)

A： HE， control; B: HE, UAC group； C： Safranine O, control; D: Safranine O, UAC group; E: Statistic analysis of safranine O staining; F: Statistic analysis of caritilage thickness

Fig 1 The HE and safranine O staining of the condyles in the control and UAC groups (×200)

BMSCs細胞爬片甲苯胺藍染色結果顯示：對照組BMSCs細胞基質未見藍紫色著色，為甲苯胺藍染色陰性；和UAC髁突軟骨塊共培養的BMSCs細胞基質有藍紫色著色，為甲苯胺藍染色陽性，說明共培養的BMSCs表達軟骨基質成分(圖 2)。

Realtime-PCR結果顯示：與對照組和UAC組髁突軟骨塊共培養的BMSCs Col2a1的基因表達水平均較未經過共培養的BMSCs高(P<0.05)，但均較軟骨細胞表達水平低(P<0.05)；與UAC組髁突軟骨培養的BMSCs Col2a1的基因表達水平較與對照組髁突軟骨共培養的低(P<0.05)(圖 2)。

2.3 2 組細胞c-myc和ERK1/2的表達水平

圖2 各組BMSCs的成軟骨分化 (甲苯胺藍染色， ×200)

Fig 2 Chondrogenic differentiation of BMSCs of the groups (Toluidine blue staining, ×200)

BMSCs細胞爬片免疫熒光結果顯示：BMSCs分別與對照組和UAC組髁突軟骨細胞塊在Transwll系統中共培養后，BMSCs均可表達c-myc和ERK1/2，但UAC組c-myc和ERK1/2陽性細胞比例較對照組低(P<0.05)(圖 3)。

3 討 論

OA的細胞治療是近幾年的研究熱點。其中間充質干細胞組織來源豐富，體外自我擴增能力強，可多向分化，被認為是對OA治療最有優勢和應用前景的種子細胞[9]。

圖3 2 組細胞c-myc和ERK1/2的表達(免疫熒光染色， *:P<0.05) (×200)

Fig 3 c-myc and ERK1/2 expression of the cells of the 3 gorups(Immunofluorescent staining, *:P<0.05) (×200)

大量的實驗表明不需要另外加刺激，體內局部注射的MSCs可自行定向遷移至病變的關節軟骨，分泌軟骨基質，部分逆轉軟骨的病變。給豬OA膝關節內注射MSCs，發現MSCs可在膝關節軟骨中定植，且表達軟骨細胞標記物——II型膠原[4]。課題組前期實驗也表明，OA軟骨能通過分泌趨化因子誘導局部注射的BMSCs向病變軟骨趨化[3]。另外，局部注射的BMSCs可定向遷移至病變髁突，定植于髁突軟骨中，并分泌II型膠原，向軟骨細胞分化[3，10]。

研究表明體外軟骨細胞與MSCs共培養可誘導MSCs成軟骨分化。 Meretoja等[11]和Diao等[12]發現關節軟骨細胞和MSCs之間的相互作用可誘導MSCs的成軟骨分化。 Kubosch等[13]建立BMSCs和軟骨細胞共培養體系，可誘導MSCs表達II型膠原的蛋白和mRNA 。 Yang等[14]的研究表明軟骨細胞可通過旁分泌模式誘導MSCs表達成軟骨分化標記物。 Mo等[15]的研究也顯示MSCs與關節軟骨細胞共培養可增加軟骨細胞軟骨外基質分泌量和II型膠原表達量。 但目前，OA和正常軟骨誘導MSCs成軟骨分化能力的差別還未見報導。本研究表明盡管正常和OA的軟骨均可誘導BMSCs成軟骨分化，但OA軟骨誘導MSCs成軟骨分化的能力遠不如正常軟骨(圖 2)。

c-myc和ERK1/2在干細胞的成軟骨分化中起著重要作用。用包括c-myc在內的數種基因轉染人絨毛膜或者蛻毛干細胞，或者轉染鼠的胚胎干細胞，可直接將這些干細胞轉變成軟骨細胞[4-5]。而抑制BMSCs的ERK1/2信號可明顯抑制其表達軟骨基質的水平[6-7]。本研究將正常或者OA的軟骨細胞與BMSCs共培養，發現2 組均可上調BMSCs的c-myc和ERK1/2表達水平，但與OA的髁突軟骨共培養的BMSCs，其c-myc和ERK1/2水平低于與正常髁突軟骨共培養組(圖 3)。本研究推測，髁突軟骨可能分泌可溶性的物質作用于BMSCs，提高BMSCs中c-myc和ERK1/2的表達，但OA髁突分泌的該物質較對照組少。

綜上所述，本研究發現OA和正常髁突軟骨均可誘導BMSCs成軟骨分化，但OA軟骨誘導BMSCs成軟骨能力較對照組弱，可能與OA髁突軟骨誘導BMSCs的c-myc和ERK1/2表達上調幅度較對照組小有關。