肥大細胞在口腔黏膜良性淋巴組織增生病中的表達及與臨床病理的關系

張昊 劉慧娟 李荷香 宋鵬 劉旭倩 侯亞麗

口腔黏膜良性淋巴組織增生病(benign lymphoadenosis of oral mucosa, BLOM)是一種臨床上并不少的口腔黏膜病。課題組前期調查[1]發現64.3%BLOM表現為黏膜糜爛潰瘍、26.5%為白紋或白斑、 9.2%為結節狀突起、臨床誤診率高達98%。由于誤診率高，多年來人們忽視了BLOM[2]，其發病機制更是少有研究。肥大細胞(mast cell, MC)[3]是一種重要的免疫細胞，它參與了機體多種生理和病理過程如過敏反應、慢性炎癥、腫瘤等。研究證實MC在口腔扁平苔蘚[4]、白斑[5]、口腔黏膜下纖維性變等組織中[6]都發現有數目的增多，提示MC在口腔黏膜病的發生中發揮了重要作用。BLOM與MC關系的研究至今少有報道。本研究采用甲苯胺藍組織化學染色和類胰蛋白酶抗體免疫組織化染色觀察BLOM中MC分布、數量及脫顆粒情況，探討MC在BLOM中表達及其與臨床病理的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

30 例BLOM蠟塊均來自河北醫科大學口腔醫院病理科作為BLOM組。15 例正常黏膜組織取自腫瘤周圍正常黏膜作為正常對照組。 30 例BLOM患者均無移植宿主疾病、丙型肝炎或艾滋病毒感染；活檢前近6 個月均沒有接受過局部或全身治療。

30 例BLOM中，男性10 例(33.33%)，平均年齡(57.3±16.5) 歲， 女性20 例(66.67%)， 平均年齡(52.6±11.9) 歲。病程0.5～240 個月不等， 平均病程(26.5±47.4) 個月，中位病程12 個月。 15 例正常黏膜組織取自腫瘤周圍正常黏膜作為正常對照組。其中男性7 例(46.67%)， 平均年齡(58.9±10.3) 歲、女性8 例(53.33%)，平均年齡(56.4±8.4) 歲。

1.2 試劑

甲苯胺藍染色試劑盒(北京雷根生物技術有限公司); 肥大細胞類胰蛋白酶單克隆抗體(Abcam公司, 英國); PV-9000免疫組化試劑盒、DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋)。

1.3 實驗方法

1.3.1 甲苯胺藍染色法 將組織蠟塊分別切成厚度為3～4 μm的切片，常規脫蠟至水，入甲苯胺藍液中染色20 min， 95%酒精分色，鏡下控制，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3.2 免疫組織化學染色法 將組織蠟塊分別切成厚度為3～4 μm的切片，脫蠟至水， 0.01 mol/L PBS沖洗5 min×3 次，放入枸櫞酸緩沖液中熱修復，一抗類胰蛋白酶抗體滴度為1∶1 000， 以后按PV9000試劑盒說明書操作，蘇木素復染，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陽性對照采用已知的陽性組織切片，空白對照用PBS代替一抗。

1.3.3 結果判讀 甲苯胺藍染色中MC計數標準參照潘倩如[7]的方法，分別將BLOM組和正常對照組每張切片在高倍視野(×400) 下選取MC數目最多的5 個視野進行計數，計算5 個視野MC總數和脫顆粒率平均值。脫顆粒率=(脫顆粒MC數/MC總數)×100%。MC判定：甲苯胺藍染色細胞核為藍色，胞核不明顯，胞漿紫紅色，細胞周圍無紫紅色顆粒溢出者為MC；免疫組織化學染色類胰蛋白酶陽性信號為胞漿出現棕黃色顆粒。甲苯胺藍染色脫顆粒MC判定：細胞核清晰或破裂、胞漿顆粒清晰，周圍組織中存在紫紅色顆粒者為脫顆粒MC。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 甲苯胺藍染色結果

①甲苯胺藍染色MC總數在BLOM組(圖 1)和正常對照組的表達(圖 1, 表 1)： MC總數在BLOM組明顯增多，彌漫分布于黏膜固有層淋巴細胞之間、淋巴濾泡周圍或血管周圍；其形態為圓形或橢圓形，細胞核藍色居中或偏位，胞漿紫紅色或含有大小不一的紫紅色顆粒。正常對照組MC總數較少，分布于黏膜上皮下，但其體積較BLOM各組明顯縮小。 BLOM組MC數目較正常對照組升高(P<0.05); ②BLOM組和正常對照組甲苯胺藍染色MC脫顆粒率(表 2) BLOM組甲苯胺藍染色MC均發生了不同程度地脫顆粒：MC破碎，核膜不清晰，周圍可見大量紫紅色顆粒(圖 2, 箭頭示)。 BLOM組MC脫顆粒率較正常對照組明顯升高(P<0.05)。

2.2 免疫組化染色結果(表 3)

類胰蛋白酶抗體免疫組織化學染色MC總數在BLOM組和正常對照組均有明顯表達(圖 3)， 但BLOM組更密集， 更明顯， 陽性細胞廣泛分布于黏膜固有層淋巴細胞之間、淋巴濾泡周圍及血管周圍。個別BLOM在黏膜上皮基底細胞層也可以看到散在陽性細胞。正常對照組陽性細胞多位于黏膜上皮下。BLOM組MC總數較正常對照組明顯升高(P<0.05)。

圖1 2 組組織中的MC的表達(甲苯胺藍染色, ×400) 圖 2 2 組組織中的脫顆粒MC(甲苯胺藍染色， ×1 000)

Fig 1 MC(arrow) expression of the 2 groups (Toluidine blue staining, ×400) Fig 2 Degranulation of MC (arrow) of the 2 groups (Toluidine blue staining, ×1 000)

表 1 甲苯胺藍染色檢測MC總數

表 2 甲苯胺藍染色MC脫顆粒率

2.3 MC總數與BLOM臨床病理的關系(表 4)

甲苯胺藍染色和類胰蛋白酶抗體免疫組織化學染色MC總數在非糜爛型、腫物型和糜爛型BLOM中依次升高(P<0.05)，但甲苯胺藍染色MC總數在BLOM各臨床分型間差異沒有統計學意義(P>0.05)，而類胰蛋白酶抗體免疫組織化學染色MC總數在各臨床分型間差異則有統計學意義(P<0.05)。 兩兩比較，免疫組織化學染色MC總數差異僅在非糜爛型和糜爛型BLOM間有統計學意義(P<0.017)，而非糜爛型和腫物型BLOM、糜爛型和腫物型BLOM之間MC總數差異無統計學意義(P>0.017)。 2 種染色MC總數與BLOM年齡、性別、部位、病程及炎癥輕重程度和黏膜固有層淋巴濾泡的形成無明顯相關性(P>0.05)。

圖3 2 組組織中的MC(箭頭示) (IHC， ×400)

Fig 3 MC(arrow) in the tissue of the 2 groups

(IHC, ×400)

表 4 MC總數與BLOM臨床病理的關系

注： ①非糜爛型與糜爛型相比，P<0.017

2.4 MC脫顆粒率與BLOM臨床病理的關系(表 5)

MC脫顆粒率在非糜爛型、糜爛型和腫物型BLOM中依次升高(P<0.05)。但兩兩比較，MC脫顆粒率僅在非糜型和糜爛型BLOM、非糜爛型和腫物型BLOM有統計學意義(P<0.017)。MC脫顆粒率與BLOM年齡、性別、部位、病程及炎癥輕重程度及和黏膜固有層淋巴濾泡的形成無明顯相關性(P>0.05)。

表 5 甲苯胺藍染色MC脫顆粒率與BLOM臨床病理的關系

注： ①非糜爛型與糜爛型相比，P<0.017

3 討 論

MC來源于骨髓造血干細胞，離開骨髓后隨血液循環遷移至與外界相通的組織和器官發育成熟，成為抵御病原體入侵的一個重要免疫細胞[8]。其胞漿常包含80～300 個嗜堿性顆粒，而且這些顆粒具有易染性，在HE染色下不易分辨，但在甲苯胺藍染色下呈現紫紅色。人類MC均含有類胰蛋白酶，它是MC的一個特異蛋白酶。 故本研究采用甲苯胺藍組織化學染色和類胰蛋白酶免疫組織化學染色觀察MC。

BLOM以淋巴濾泡形成或淋巴細胞灶狀聚集為病理特征，孫開華等[9]認為它是某種刺激引起的反應性增生性疾病。課題組前期調查發現43.9%BLOM上皮內均可見到不同程度的病毒感染，提示病毒可能是刺激因素之一。病毒或病毒代謝產物可能激活存在于黏膜組織中的少量MC，使其分泌TNF-α或其它炎癥介質，募集中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和其它炎癥細胞到病變部位[10]。課題組前期對BLOM臨床病理調查發現： 51%BLOM上皮有中性粒細胞浸潤， 41.8% BLOM 黏膜固有層有不同程度嗜酸性粒細胞浸潤、所有BLOM固有層均有淋巴細胞和漿細胞浸潤[1]。MC不僅能加強對病毒的清除，它也可能成為其共同聚集、復制和逃避免疫的場所[10]，使病毒存活并不斷復制，刺激黏膜組織導致黏膜固有層淋巴濾泡的形成，發生BLOM。本研究中甲苯胺藍組織化學染色和類胰蛋白酶抗體免疫組織化學染色均顯示BLOM組中MC總數較正常對照組明顯增高，與平昭[11]研究結果相同。這提示MC在BLOM發生中發揮了重要作用。但是，對于MC增殖機制至今尚不清楚。劉雪梅[12]認為MC在腫瘤、炎癥等部位的聚集是通過MC或其前體細胞的移動來實現。莊玉等[13]認為MC增殖在一定程度上依賴于T淋巴細胞，部分MC是由于T淋巴細胞受到刺激后轉化而來。

本研究結果顯示：無論是甲苯胺藍染色還是類胰蛋白酶抗體免疫組織化學染色，BLOM組MC總數都明顯高于正常對照組(P<0.05)。但是兩種染色MC總數在BLOM各臨床分型間卻出現了不同結果：甲苯胺藍染色MC總數在臨床各分型間無差異，而免疫組織化學染色卻有顯著性差異。這可能是由于甲苯胺藍染色時需要95%乙醇分化，其分化程度不同可能影響其染色結果，從而影響MC計數。而免疫組織化學染色較為敏感，導致了兩種染色結果的不同。本研究認為用免疫組織化學方法觀察MC總數更為敏感和特異，與Dinakar等[14]意見一致。BLOM組各臨床分型間兩兩比較，免疫組織化學染色MC總數僅在糜爛型和非糜爛型BLOM間有差異，而兩者和腫物型BLOM相比較均無差異。推測這可能是由于糜爛型、非糜爛型BLOM與腫物型BLOM病理變化不同造成。腫物型BLOM和其它兩型病理變化不同：腫物型BLOM病理變化似纖維上皮息肉或鱗狀細胞乳頭狀瘤，固有層除淋巴濾泡形成外，還有大量纖維結締組織增生。而糜爛型和非糜爛型BLOM病理變化相似，是一種慢性炎癥的改變。這提示腫物型BLOM和糜爛型、非糜爛型BLOM發生機制可能不同。

MC胞漿中的顆粒包含大量貯存各種炎癥的介質。某種抗原刺激機體后，機體免疫系統產生IgE抗體，抗原抗體結合激活MC，使其脫顆粒釋放炎癥介質和多種細胞因子如：蛋白水解酶(類胰糜蛋白酶、胃促胰酶、肥大細胞羧基肽酶)、組胺、肝素、硫酸軟骨素E和堿性成纖維細胞生長因子、腫瘤壞死因子等降解結締組織基質[15]，對周圍組織造成損傷并且促進淋巴細胞的浸潤，加重炎癥反應。本研究結果顯示：BLOM組MC脫顆粒率較正常對照組明顯升高，提示某種刺激導致的MC脫顆粒可能參與了BLOM的發生。推測BLOM復雜多樣的臨床表現可能和MC脫顆粒時釋放不同的細胞因子有關。BLOM臨床主要表現為糜爛，潰瘍。可能是由于MC釋放了類胰糜蛋白酶，破壞上皮基底膜處的層黏連蛋白和Ⅳ型膠原蛋白[16]導致潰瘍形成，發生糜爛型BLOM。類胰蛋白酶還能刺激成纖維細胞不斷增殖[17]，促進膠原纖維增生。MC脫顆粒釋放的肝素能夠促進膠原成熟，從而形成腫物型BLOM。本研究發現MC脫顆粒率在非糜爛型、糜爛型和腫物型BLOM中依次升高，是否提示非糜爛型、糜爛型和腫物型BLOM可能是其3 個不同的發展階段，有待于進一步研究。 研究結果還顯示2 種染色MC總數和免疫組織化學染色MC脫顆粒率均與BLOM年齡、性別、部位、病程、炎癥輕重程度及黏膜固有層淋巴濾泡的形成無明顯相關性，推測BLOM的發生發展是一個多因素參與的復雜過程。

綜上所述，BLOM的發生發展是一個復雜的過程，其中MC和BLOM密切相關，其增殖和脫顆粒可能在BLOM發生發展中發揮了重要作用。