當歸芍藥散對缺血性腦卒中小鼠腦保護作用的影響

李海燕，楊勇，高晨，任長虹

論著·實驗研究

當歸芍藥散對缺血性腦卒中小鼠腦保護作用的影響

李海燕1，楊勇2，高晨1，任長虹1

1.首都醫科大學宣武醫院低氧醫學研究所，北京 100053；2.北京中醫藥大學基礎醫學院，北京 100029

觀察當歸芍藥散對缺血性腦卒中小鼠腦保護作用的影響，探討其可能的作用機制。取成年C57雄性小鼠，制備大腦中動脈梗阻（MCAO）模型。實驗小鼠隨機分為假手術組（Sham組）、模型組（MCAO組）和當歸芍藥散組（DSS組），進行神經功能評分和腦組織TTC染色，觀察小鼠神經功能和腦梗死體積，免疫熒光染色和電化學發光法檢測小鼠腦組織相關指標水平。與MCAO組比較，DSS組小鼠腦梗死體積明顯減小（＜0.001），細胞凋亡數目明顯減少（＜0.05），神經功能有一定程度的恢復（＜0.01），小膠質細胞/巨噬細胞數量明顯減少（＜0.01），同時，當歸芍藥散可促進M2型巨噬細胞/小膠質細胞極化（＜0.01），降低促炎因子、增加抑炎因子的表達（＜0.01，＜0.001）。當歸芍藥散對缺血性腦卒中小鼠具有腦保護作用，其機制可能與其抑制細胞凋亡、調節小膠質細胞極化有關。

當歸芍藥散；缺血性腦卒中；小膠質細胞極化；炎性反應；小鼠

腦中風以其高發病率、高復發率、高致殘率、高死亡率及逐年遞增的防治費用成為危害人民健康最為嚴重的疾病之一，其人群疊加效應和快速增長給社會、家庭造成巨大的經濟負擔和精神壓力，已成為嚴重影響國計民生的重要公共衛生問題[1-2]。因此，研究有效治療藥物對社會意義重大。當歸芍藥散對腦缺血再灌注損傷的神經保護作用已得到共識[3]，然而其確切機制尚不十分明確。小膠質細胞是中樞神經系統免疫細胞，參與缺血性腦損傷的炎癥反應和損傷修復[4]。在缺血性腦損傷中，小膠質細胞表現為M1和M2兩種不同的極化表型[5-6]。本研究制備小鼠大腦中動脈梗阻（MCAO）模型，觀察當歸芍藥散對缺血/再灌注腦損傷模型小鼠保護作用的影響，探討其可能的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級C57/BL6雄性小鼠88只，體質量20～24 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2007-0001。飼養于首都醫科大學宣武醫院實驗動物中心，溫度（22±2）℃、相對濕度（45±5）%，日照時間12 h。小鼠分籠喂養，每5只1籠，自由攝食飲水。

1.2 藥物及制備

當歸芍藥散（當歸、川芎、白芍、澤瀉、茯苓、白術比例為3∶3∶16∶8∶4∶4），飲片購自北京同仁堂，采用醇提水沉法提取各個樣品，按1∶5（W/V）比例加入95%乙醇，室溫過夜，然后煮沸2次×2 h。過濾，離心，留取提取液，剩余藥物殘渣加入蒸餾水（1∶4，W/V）煮沸2次×1 h。過濾，離心，留取提取液，將2次提取液混合測濃度，調至為1 g/mL，4 ℃冰箱保存備用。

1.3 主要試劑與儀器

恩氟烷（河北一品制藥制藥股份有限公司，批號C001180702），2,3,5-氯化三苯基四氮唑藍（TTC）（Sigma，貨號17779），抗cleaved Caspase3多克隆抗體（Abcam，貨號ab2302），抗CD68多克隆抗體（Santa Cruze，貨號sc-20060），抗CD16/32多克隆抗體（Abcam，貨號ab25235），抗CD206多克隆抗體（Abcam，貨號ab64693），抗Iba1抗體（Wako，貨號019-19741），免疫熒光二抗（Lifetechnologies，貨號A-21203，A-32723）。小動物肛溫檢測儀（Harvard Apparatus），電子分析天平（瑞士Mettler公司，型號AE160），高頻小電刀（上海醫療器械技術公司，型號1411），ROTO-ROD儀（IITC Life Science，型號092517-755），激光共聚焦顯微鏡（Leika，型號TCS SP8）。

2 實驗方法

2.1 造模

小鼠稱重后予5%恩氟烷誘導麻醉，1%～2%恩氟烷混合70%N2O和30%O2維持麻醉，采用Zea Longa線栓法[7]制備小鼠右側MCAO模型，小鼠腹下墊恒溫墊，術中肛溫維持在（37±2）℃。術中小心分離右側頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈，將線拴由頸外動脈殘端插入頸內動脈，至距頸內動脈和頸外動脈分叉處約1.8 cm，栓塞60 min后拔除栓子，制備缺血/再灌注損傷模型。手提小鼠尾部，可見左側前肢屈曲，視為模型成功。假手術組（Sham組）僅分離上述各血管，不插入線拴。

2.2 分組及給藥

實驗小鼠隨機分為Sham組、MCAO組和當歸芍藥散組（DSS組），每組8只。根據前期研究工作[8]，換算小鼠每日當歸芍藥散給藥量為866 mg/kg。DSS組給予當歸芍藥散藥液灌胃，MCAO組給予等量生理鹽水灌胃。各組均在缺血30 min后第1次給藥，給藥體積10 mL/kg，每日1次，給藥1 d或3 d。

2.3 腦梗死體積測定

術后3 d（每組7只）處死小鼠，在視交叉處向后切厚度為1 mm冠狀切片4片，視交叉前切2片。將腦片置于用PBS（pH 7.4）配制1%TTC染液，37 ℃染色5 min。正常腦組織染成深紅色，缺血腦組織染成蒼白色。相機拍攝，使用ImagePro Plus圖像分析軟件計算腦梗死面積[9]。梗死面積百分率（%）＝梗死區腦組織體積÷正常側大腦半球體積×100%。

2.4 神經功能缺損嚴重程度評分

術前1 d及術后1、3、5、7 d（每組8只）進行神經功能缺損嚴重程度評分，包括運動功能和感覺功能檢測[10]。運動功能檢測：提起小鼠尾部（正常0分，前肢屈曲1分，后肢屈曲1分，頭部在30 s內沿垂直軸移動＞10°1分，最大值3分）；將小鼠放置地面（正常0分，無法直走1分，向輕癱側打轉2分，向輕癱測傾倒3分）。感覺功能檢測：觸覺反應通過用牙簽碰觸前爪掌區來實現（正常0分，減緩反應1分，無反應2分）；本體感覺反應通過用棉棒放在雙側脖頸處實現（正常0分，減緩反應1分，沒有反應2分）。將所有評分相加作為神經功能缺損嚴重程度最后分值。

2.5 轉棒實驗

術前1 d及術后3、5、7 d（每組8只）進行轉棒實驗。將小鼠放在加速旋轉的轉棒上（5 min內從4 r/min加速到40 r/min），直到小鼠掉落，記錄停留時間，5 min內仍未掉下按5 min計算。每只小鼠每日進行3次實驗，實驗間隔20 min。

2.6 免疫熒光染色方法檢測cleaved Caspase-3、CD68、Iba1、CD16/32和CD206的表達

術后1 d（每組6只）取材，檢測cleaved Caspase-3的表達；術后3 d（每組6只）取材，檢測CD68、Iba1、CD16/32和CD206的表達。小鼠麻醉后使用生理鹽水由心臟灌注，取腦組織后固定于4%多聚甲醛（4%PFA），置于4 ℃冰箱，經30%蔗糖脫水，至腦組織自然沉淀，冰凍切片10 μm。用1%BSA-PBST，室溫封閉60 min。甩去封閉液，滴加一抗，濕盒內4 ℃孵育過夜。PBS清洗3次，每次10 min。二抗用Alex488或Alex594標記。不加一抗作為陰性對照，以確認抗體免疫反應特異性。室溫避光孵育1 h，PBS清洗3次，每次10 min。用含有DAPI的封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察，使用Image Pro Plus V軟件進行分析。

2.7 電化學發光法檢測促炎因子和抑炎因子的表達

小鼠術后3 d（每組6只）取梗死側腦組織，用RIPA buffer按照1∶9（W/V）比例裂解蛋白。用BCA法檢測蛋白濃度。配制1×PBS（0.05%吐溫-20）清洗液，配制2×讀板液，每孔加150 μL Blocker H溶液，并用封口膜封上，室溫孵育1 h，清洗電化學發光板3次，每次150 μL清洗液，每孔加入50 μL樣本、標準品和質控品，并用封口膜封上，室溫振蕩2 h，清洗電化學發光板3次，每次150 μL清洗液，每孔加入配制好的25 μL檢測抗體，并用封口膜封上，室溫振蕩2 h，清洗電化學發光板3次，每次150 μL清洗液，每孔加入150 μL配制好的讀板液，上機檢測。

3 統計學方法

4 結果

4.1 當歸芍藥散對模型小鼠腦梗死體積及神經細胞凋亡的影響

與MCAO組比較，DSS組小鼠腦梗死體積明顯減小，差異有統計學意義（＜0.001），結果見圖1。

4.2 當歸芍藥散對模型小鼠神經細胞凋亡的影響

術后1 d檢測梗死周邊區細胞凋亡的數量，用抗cleaved Caspase-3抗體標記凋亡細胞，結果顯示，與MCAO組比較，DSS組小鼠細胞凋亡數量減少，差異有統計學意義（＜0.05），結果見圖2、圖3。

注：a. Sham組；b. MCAO組；c. DSS組；d.高倍圖（DSS組）

注：與MCAO組比較，*P＜0.05

4.3 當歸芍藥散對小鼠神經功能評分和轉棒停留時間的影響

與MCAO組比較，DSS組小鼠腦組織神經功能有所改善，各時間點神經功能評分較MCAO組低，轉棒停留時間更長，差異有統計學意義（＜0.01）。結果見圖4。

注：與MCAO組比較，**P＜0.01

4.4 當歸芍藥散對模型小鼠腦組織梗死周邊區小膠質細胞/巨噬細胞數量的影響

采用CD68抗體標記小膠質細胞/巨噬細胞，結果顯示，與MCAO組比較，DSS組降低腦組織小膠質細胞/巨噬細胞活力，差異有統計學意義（＜0.01）。結果見圖5、圖6。

圖5 各組小鼠腦組織小膠質細胞/巨噬細胞形態（免疫熒光染色，標尺＝50 μm）

注：與MCAO組比較，**P＜0.01

4.5 當歸芍藥散對模型小鼠腦組織M1和M2型巨噬細胞/小膠質細胞極化的影響

免疫熒光雙標方法檢測M1型（CD16/32）及M2型（CD206）小膠質細胞，與MCAO組比較，DSS組小鼠腦組織M1陽性標志物CD16/32+/Iba1+表達顯著降低，差異有統計學意義（＜0.01），見圖7、圖8。同時，DSS組小鼠腦組織M2型巨噬細胞/小膠質細胞數量（標志物為CD206+/Iba1+細胞）顯著增加，差異有統計學意義（＜0.01），見圖9～圖10。

4.6 當歸芍藥散對模型小鼠腦組織促炎因子和抑炎因子水平的影響

與MCAO組比較，DSS組小鼠腦組織促炎因子腫瘤壞死因子（TNF）-α和白細胞介素（IL）-6水平降低，抑炎因子IL-10水平增加，差異有統計學意義（＜0.01），結果見圖11。

圖7 各組小鼠腦組織M1型小膠質細胞陽性表達（免疫熒光染色，標尺＝50 μm）

注：與Sham組比較，#P＜0.05；與MCAO組比較，**P＜0.01

圖9 各組小鼠腦組織M2型小膠質細胞陽性表達（免疫熒光染色，標尺＝50 μm）

注：與Sham組比較，#P＜0.05；與MCAO組比較，**P＜0.01

注：與Sham組比較，#P＜0.05；與MCAO組比較，**P＜0.01，***P＜0.001

5 討論

當歸芍藥散出自《金匱要略》，主治“婦人懷妊，腹中疞痛”及“婦人腹中諸疾痛”。近年來，該方被用于腦血管疾病，如血管性癡呆、腦梗死等[11-13]。有研究報道，當歸芍藥散治療腦梗死機制可能是通過干預基質金屬蛋白酶-9發揮腦保護作用[14]。

小膠質細胞是大腦中的巨噬細胞，在發育、維持機體的穩態和在疾病的病理生理中具有重要的作用[15-16]。在生理條件下，小膠質細胞主要處于靜息狀態（M0），組織遭受缺血缺氧等損傷后，小膠質細胞被激活，出現2種主要表型，即“經典激活”（M1型）和“選擇性激活”（M2型）。M1型小膠質細胞分泌多種促炎因子，如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α[17-18]，而M2型小膠質細胞產生具有抑炎作用的細胞因子IL-10和轉化生長因子-β等。

本研究結果顯示，當歸芍藥散治療后，模型小鼠神經功能得到改善，神經細胞凋亡數量減少。同時，與MCAO組比較，DSS組小膠質細胞總量減少，M1型小膠質細胞數量減少，促炎因子TNF-α、IL-6水平降低，M2型小膠質細胞數量增加，抑炎因子IL-10水平升高。由此我們推斷，當歸芍藥散對缺血性腦損傷具有比較明確的保護作用，可能與調控小膠質細胞的極化有關。腦為奇恒之府，是髓之海，由腎精充養，是神明所居，亦為心神之機關，腦髓由經絡和血絡貫連，腦絡是腦神的功能和結構載體，具有貫通營衛、環流經氣、滲透氣血、互化津血的生理功能，是內外溝通的橋梁，腦髓之絡脈暢達，氣血充盈是其發揮功用的結構和物質基礎。脾主化生氣血，升發清陽，是腦髓發揮正常功能的物質源泉，肝主疏泄調達，能保障腦髓絡脈的疏通暢達，如果脾失健運，水濕內停，上犯腦絡，肝失疏泄，血瘀絡阻，均可影響腦絡，而致腦絡受損，神機失養，造成神機運動物質基礎匱乏，臟腑形骸信息聯絡欠暢，如果損傷日久，濕聚成痰，瘀久生熱，甚至化火動風，則中風病的發生在所難免。當歸芍藥散以當歸、白芍、川芎調肝理血，白術、茯苓、澤瀉健脾調津，全方三血三水之品相濟并用，共奏調肝健脾、活血利水之功。有研究報道，當歸芍藥散能改善中風后患者生存質量，提高獨立生活能力[3]。我們以往的研究結果發現，當歸芍藥散能促進缺血性中風亞急性期神經功能恢復，促進血管新生、神經再生[8]。

綜上，臨床實踐的拓展和基礎研究的深入以及中醫腦病理論的創新讓我們對古方新用研究有了長足發展，當歸芍藥散在神經保護作用方面的應用有待深入研究。

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Protective Effects ofPowder on the Brain of Mice with Cerebral Ischemic Stroke

LI Haiyan1, YANG Yong2, GAO Chen1, REN Changhong1

To observe the protective effects ofPowder (DSS) on the brain of mice with cerebral ischemic stroke; To explore its possible mechanism.Adult C57 male mice were used to create the middle cerebral artery obstruction (MCAO) model. Mice which were randomly divided into sham-operation group, MCAO group and DSS group. The mice were scored for neurological function and TTC staining of brain tissue, and the neurological function and cerebral infarction volume were observed. Immunofluorescence staining and electrochemical luminescence were used to detect the levels of brain tissue related indicators.Compared with the MCAO group, the cerebral infarction volume of DSS group was reduced (<0.001), the number of apoptosis decreased (<0.05), the neurological function was restored (<0.01), and the number of microglia/macrophages decreased (<0.01). Meanwhile, DSS promoted the polarization of M2-type macrophages/microglias (<0.01), decreased the expression of pro-inflammatory factors and increased the expression of anti-inflammatory factors (<0.01,<0.001).DSS has brain protective effects on brain of male mice with ischemic stroke, and the mechanism may be related to inhibiting cell apoptosis and regulating microglial polarization.

Powder; cerebral ischemic stroke; microglia polarization; inflammatory reaction; mice

R285.5

A

1005-5304(2020)06-0038-06

10.3969/j.issn.1005-5304.201911279

國家自然科學基金（81573867、81473591）

任長虹，E-mail：rench@xwhosp.org

（2019-11-14）

（2019-12-18；編輯：華強）