當歸四逆湯治療糖尿病周圍神經病變靶點預測和機制探討

邢琪昌，陳佳，劉征，江雅琴，李偉

當歸四逆湯治療糖尿病周圍神經病變靶點預測和機制探討

邢琪昌，陳佳，劉征，江雅琴，李偉

湘潭市中心醫院藥學部，湖南 湘潭 411100

采用網絡藥理學方法對當歸四逆湯治療糖尿病周圍神經病變（DPN）的相關靶點進行預測，并探討其作用機制。利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）篩選當歸四逆湯有效成分和相關靶點蛋白，通過Drugbank、TTD、DisGeNET數據庫檢索并篩選DPN疾病相關靶點，整合篩選出當歸四逆湯有效成分與DPN交集靶點，運用Cytoscape3.2.1軟件構建當歸四逆湯成分-靶點-疾病網絡，通過在線分析工具Enrichr對當歸四逆湯治療DPN作用靶點進行GO生物過程和KEGG通路富集分析。當歸四逆湯中28個活性成分對應作用于152個靶點蛋白，其中32個靶點與DPN相關。富集分析結果顯示，該方可能通過作用MAPK級聯正向調節等生物過程和糖基化終末產物-受體等信號通路發揮作用。當歸四逆湯治療DPN具有多靶點、多途徑、整體調節作用特點。

當歸四逆湯；糖尿病周圍神經病變；網絡藥理學；靶點；機制

糖尿病周圍神病變（diabetic peripheral neuropathies，DPN）是臨床最常見的糖尿病慢性并發癥之一。DPN患者臨床多見溫覺或痛覺異常、感覺和運動神經元傳導功能下降，表現為肢體麻木、疼痛，甚至感覺障礙、肌肉無力等癥狀和體征，嚴重危害糖尿病患者生存質量，是患者致殘、致死的危險因素。根據DPN臨床表現，可將其歸屬于中醫學“痿證”“血痹”等范疇，其病機主要與病程日久所致陰陽氣血虧虛、血行瘀滯、脈絡痹阻等相關[1]。臨床可將DPN分為氣虛血瘀、陽虛寒凝等證型，當歸四逆湯為治療陽虛寒凝型DPN之方藥[2-3]。

當歸四逆湯出自《傷寒論?辨厥陰病脈證并治》：“手足厥寒，脈細欲絕者，當歸四逆湯主之。”該方由當歸、桂枝、白芍、細辛、通草、甘草和大棗組成。方中當歸入肝經，行補血活血之用；桂枝味辛溫，溫經通脈；白芍養血平肝；細辛外溫經脈，內通臟腑；通草通經脈；甘草、大棗調和諸藥。全方共奏充陰血、除客寒、振陽氣、通經脈之功，以達溫手足而脈亦復之效。現代臨床中，當歸四逆湯被廣泛應用于血管性頭痛、坐骨神經痛、肩周炎等疾病[4]，藥理研究表明其具有抗凝、抗血栓[5]及擴張末梢血管、鎮痛、抗炎、解痙等作用[6]。然而當歸四逆湯治療DPN的作用機制目前尚不明確。

中藥以其多成分、多靶點、多途徑的作用特點在疾病治療中具有獨特優勢，同時也為闡釋其作用機制和物質基礎帶來巨大挑戰。近年來，網絡藥理學技術的誕生與發展為中藥復方研究提供了新的思路和策略，其基于藥物成分-靶點-疾病等多層次的相互作用網絡，整體性、系統性闡釋藥物與疾病的關聯，其特點與中藥及其方劑作用的整體性、復雜性相契合[7]。本研究以當歸四逆湯主要活性物質為研究對象，運用網絡藥理學方法構建成分-靶點-疾病網絡，系統預測作用靶點，為深入闡釋當歸四逆湯治療DPN的作用機制提供依據。

1 資料與方法

1.1 藥物化學成分檢索與篩選

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[8]檢索當歸四逆湯中當歸、白芍、桂枝、細辛、通草、甘草、大棗的化學成分，并以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為條件篩選所得化合物。

1.2 有效成分-靶點網絡構建

將篩選后的化合物編號輸入TCMSP，檢索其對應靶點，整理獲得化合物-靶點Excel表格，上傳至Cytoscape3.2.1軟件，生成藥物-靶點相互作用網絡圖。

1.3 疾病靶點搜集

通過Drugbank（https://www.drugbank.ca/）、TTD（https://db.idrblab.org/ttd/）、DisGeNet（http://www. disgenet.org/）數據庫[9-11]，以“diabetic peripheral neuropathies or diabetic neuropathy”為檢索詞，搜集與DPN相關的靶點。

1.4 藥物有效成分與疾病交集靶點網絡構建

將當歸四逆湯有效成分靶點通過Uniprot轉換為對應基因名并對應注明Uniprot ID。將搜集到的DPN疾病相關靶點與藥物有效成分靶點置于同一列，運用Excel（Office 365 MSO）篩選功能，以Uniprot ID為查詢條件，映射出當歸四逆湯每個活性成分靶點與DPN疾病相關靶點重合部分，獲得成分靶點與疾病靶點交集的關鍵靶點，并構建成分-靶點-疾病網絡。

1.5 靶點富集分析與機制預測

運用在線基因集富集分析工具Enrichr（http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/）分析藥物有效成分與疾病交集關鍵靶點基因的GO生物過程和KEGG通路[12]，挖掘并預測當歸四逆湯治療DPN作用機制相關途徑和通路。對所得KEGG通路進行深入挖掘，預測并構建當歸四逆湯治療DPN的分子網絡圖。

2 結果

2.1 當歸四逆湯活性化合物及其靶點

通過TCMSP共收集到當歸四逆湯化合物813個，其中當歸125個、桂枝106個、細辛67個、通草32個、白芍77個、大棗125個、甘草280個。按OB≥30%、DL≥0.18條件篩選后，得到當歸2個、桂枝5個、細辛8個、通草4個、白芍13個、大棗28個、甘草92個，經去重，共得到138個化合物。檢索其對應靶點，結果顯示有28個化合物分別作用于152個靶點，見表1。

表1 當歸四逆湯活性化合物基本信息

化合物代碼化合物名稱OB/%DL靶點數來源 MOL000449Stigmasterol43.830.7644當歸 MOL000073ent-Epicatechin48.960.2418桂枝 MOL001736(-)-taxifolin60.510.2718桂枝 MOL001558sesamin56.550.8324細辛 MOL001460Cryptopin78.740.7245細辛 MOL000359sitosterol36.910.75 6通草 MOL001918paeoniflorgenone87.590.37 3白芍 MOL001919Compound 143.560.53 5白芍 MOL001924paeoniflorin53.870.79 2白芍 MOL001928albiflorin_qt66.640.33 2白芍 MOL000096(-)-catechin49.680.2422大棗 MOL000098quercetin46.430.2887大棗 MOL000211Mairin55.380.78 4大棗 MOL000358beta-sitosterol36.910.7551大棗 MOL000492(+)-catechin54.830.2423大棗 MOL000627Stepholidine33.110.5445大棗 MOL000787Fumarine59.260.8344大棗 MOL001454berberine36.860.7829大棗 MOL001522(S)-Coclaurine42.350.2437大棗 MOL000239Jaranol50.830.2921甘草 MOL000354isorhamnetin49.600.3136甘草 MOL000392formononetin69.670.2136甘草 MOL000417Calycosin47.750.2425甘草 MOL000422kaempferol41.880.2455甘草 MOL000497licochalcone a40.790.2931甘草 MOL000500Vestitol74.660.2132甘草 MOL001484Inermine75.180.5431甘草 MOL001792DFV32.760.1824甘草

2.2 當歸四逆湯成分-靶點-疾病網絡

共搜集到DPN相關靶點114個，將其與當歸四逆湯152個成分靶點蛋白取交集，得到當歸四逆湯治療DPN作用靶點32個，通過Cytoscape3.2.1構建成分-靶點-疾病網絡，結果見圖1。

2.3 GO生物過程和KEGG通路富集分析

將32個交集靶點輸入Enrichr，檢索后查看Ontologies項下GO Biological Process 2018（sorted by p-value ranking），結果見圖2；查看Pathways項下KEGG 2019 Human（sorted by p-value ranking），值最小的前10位生物過程和通路見圖3。

2.4 潛在分子機制

對上述成分-靶點和作用通路進行深入挖掘。當歸四逆湯有效成分可能直接作用于阿片受體（OPR）和去甲腎上腺素受體（ADR），產生鎮痛療效；通過作用于乙酰膽堿受體（CHRM）影響神經信號傳導；通過作用于胰島素受體（INSR）參與調節脂肪酸代謝，減少脂毒性；此外，當歸四逆湯也可參與周圍神經組織炎性因子的合成與釋放過程，從而減少神經細胞功能損傷；糖基化終末產物（AGEs）可能通過結合其受體（RAGEs），進一步激活NADPH氧化酶，誘導氧化應激，并通過p38（MAPK）途徑活化核因子-κB（NF-κB），從而調控白細胞介素（IL）-1B、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α等細胞因子引起神經細胞凋亡，當歸四逆湯可直接或間接調控該通路中相關蛋白，發揮治療DPN作用。見圖4。

注：菱形代表化合物，橢圓代表靶點

圖2 當歸四逆湯治療DPN靶點GO生物過程富集分析

圖3 當歸四逆湯治療DPN靶點KEGG通路富集分析

注：黃色框代表直接作用靶點，白色框代表相關作用靶點，紅色字代表作用通路

3 討論

研究顯示，高血糖、胰島素抵抗、脂代謝紊亂、神經滋養血管病變及代謝性炎癥等因素可影響DPN過程[13]。高糖環境下，神經細胞外脂肪和蛋白質的AGEs與RAGEs結合，可以破壞髓鞘的完整性，影響神經組織的微管蛋白，從而引起神經分泌障礙、軸索神經傳導缺陷以及軸索萎縮，使細胞內基質蛋白對周圍神經纖維的營養作用受到損害，神經的再生和修復受阻[14]；有研究表明，血脂紊亂能夠加重外周神經功能損傷，在高糖合并高脂情況下，雪旺細胞可出現內質網應激和鈣穩態失衡[15]。蛋白激酶C（PKC）是G蛋白偶聯受體系統中的效應物，在高糖環境下，葡萄糖轉化三磷酸甘油醛和磷脂酸，其作為PKCβ的底物轉化為二酰甘油，PKC通路被激活，導致血管組織通透性增加和功能障礙[16]，抑制PKC的激活能夠增加皮膚微血管血流和減輕感受癥狀[17]；也有研究表明，DPN患者血清C反應蛋白、TNF-α及IL-6濃度更高[18]，這一現象可能與異常的代謝通路產生AGEs而激活NF-κB有關，NF-κB進一步增加炎癥相關基因表達，刺激產生轉化生長因子-β等細胞因子，單核細胞滲出，粒細胞、吞噬細胞聚集，引起局部缺血-再灌注，導致血管及神經細胞受損[19]。

當歸四逆湯中主要活性成分包括Stigmasterol（豆甾醇）、taxifolin（花旗松素）、Cryptopin（隱品堿）、sitosterol（谷甾醇）、paeoniflorin（芍藥苷）、quercetin（槲皮素）、licochalcone a（甘草查爾酮a）等，具有廣泛的抗炎、抗氧化、鎮痛、降血脂等功效[20-21]。本研究結果表明，該方中共有28個活性化合物作用于152個靶點，其中32個靶點與DPN相關，生物過程富集分析結果顯示，該方可能影響腺苷酸環化酶激活腎上腺素能受體信號通路（adenylate cyclase-activating adrenergic receptor signaling pathway）、磷脂酶C激活G蛋白偶聯受體信號通路（phospholipase C-activating G-protein coupled receptor signaling pathway）和MAPK級聯正向調節（positive regulation of MAPK cascade）等生物過程，這些生物過程涉及細胞生長增殖、神經-激素分泌調節、能量代謝等[22-23]，可能與DPN的發生和發展相關，當歸四逆湯可能通過改善這些生物學過程發揮周圍神經保護作用。KEGG通路富集分析結果顯示，當歸四逆湯活性成分作用靶點集中作用于神經活性配體-受體相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction）、鈣離子信號通路（Calcium signaling pathway）、脂肪細胞脂解的調控（Regulation of lipolysis in adipocytes）、糖尿病并發癥的糖基化終末產物-受體信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）等，提示當歸四逆湯可能通過調節上述多條信號通路發揮作用。

綜上，DPN涉及復雜而相互關聯的發病機制，針對單一發病機制的治療方案難以取得理想效果。當歸四逆湯治療DPN具有多成分、多靶點、多作用途徑的特點，運用網絡藥理學方法對其作用機制和物質基礎進行研究，對闡釋其科學內涵具有重要意義。

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Discussion on Mechanism and Targets Forecast ofDecoction for Diabetic Peripheral Neuropathy

XING Qichang, CHEN Jia, LIU Zheng, JIANG Yaqin, LI Wei

To forecast related targets ofdiabetic peripheral neuropathy (DPN) treated byDecoction based on network pharmacology; To discuss its mechanism of action.TCMSP were used to screen active components and related target proteins ofDecoction. The targets related to DPN were searched and screened through Drugbank, TTD and DisGeNET database, and then intersection targets of active components and DPN were screened. The components-targets-disease interaction network was established by Cytoscape 3.2.1, and the GO analysis and KEGG enrichment for DPN targets treated byDecoction were conducted through online analysis tool Enrichr.Totally 28 active components inDecotion acted on 152 target proteins, 32 of which were related to DPN. The GO analysis and KEGG enrichment results showed that this prescription may play a role by acting on biological processes such as positive regulation of the MAPK cascade and signal pathways such as end-glycosylation products-receptors.The treatment ofDecotion for DPN has the characteristics of multi-target, multi-path, and overall regulation.

Decotion; diabetic peripheral neuropathy; network pharmacology; targets; mechanism

R259.872；R285

A

1005-5304(2020)06-0101-05

10.3969/j.issn.1005-5304.201905204

湖南省中醫藥科研計劃（201999）

李偉，E-mail：67324457@qq.com

（2019-05-15）

（2019-06-04；編輯：陳靜）