基于系統生物學的中醫證候研究進展

盧冬雪，劉峰，嚴晶，孫志廣

綜述

基于系統生物學的中醫證候研究進展

盧冬雪1，2，劉峰3，嚴晶1，孫志廣1

1.南京中醫藥大學，江蘇 南京 200032；2.南京中醫藥大學第二附屬醫院，江蘇 南京 210017；3.南京市浦口中醫院，江蘇 南京 210031

“證候”是中醫領域研究的核心問題，但中醫證候缺乏客觀、量化指標制約中醫學的發展和中醫現代化的進程。代謝組學、基因組學、蛋白質組學構成了系統生物學的主要研究內容，其靈魂在于“整合”，與中醫學“整體觀”異曲同工。基于系統生物學挖掘中醫證候的本質，使中醫證候的辨識更具有可信度。本文綜述近年來系統生物學在中醫證候研究中的應用。

系統生物學；中醫證候；客觀化；整體觀；本質；代謝組學；基因組學；蛋白質組學；綜述

辨證論治是中醫的特色和精髓，而“證”的辨識是辨證論治的核心，是承接中醫理法方藥的關鍵[1]。傳統中醫學的現代化是當下醫學發展不可逆轉的趨勢，缺乏可客觀量化指標，對疾病本質的揭示相對落后，限制了中醫藥向國際發展的進程。系統生物學在生命科學研究領域的發展如火如荼，在中醫藥領域被廣泛地應用[2]。茲就相關研究作一綜述。

1 “證候”定義

“證候”是機體在疾病不同階段病理變化的本質概括。中醫學的“有諸內必形諸外”從另一角度說明外在功能表現對應內在物質基礎的本質[3]。“證候”的內涵伴隨著“證候”本質不斷揭示被現代醫學進一步挖掘。宋劍南[4]將其定義為一種特定時空下生理、病理信息的綜合。基于證候要素方面：“每一種證候都是若干證候要素及其靶位的結合，病因、病機即為證候要素，證候要素發生部位則為證候要素靶位。”[5]“證”的本質被不斷深化與現代科學化。

2 系統生物學概念

“系統生物學”是整體研究生物體內氨基酸、蛋白質、代謝物等之間的生物學過程，并輔助以生物學和高通量技術的學科[6]。整合、信息、干涉是其特點，換言之，其研究的是在人為控制的狀態下，揭示出特定的生命系統的動態的動力學特征[7-8]。

3 “證候”本質與系統生物學

已有不少研究針對證候標準化、客觀化問題進行了深入探索，在腎本質[9]、脾虛證本質[10]、血瘀證本質[11]等方面獲得成果，但中醫的整體觀與恒動觀無法用西醫還原論解釋。中醫藥的量化、客觀化在系統生物學推動下飛速發展，其從DNA、mRNA、蛋白質、代謝物等不同層面探索，綜合體現了現代醫學整合思想和個體化的醫療手段[12-13]，其科學內涵相通于中醫學治未病、整體觀、辨證施治、理法方藥等基礎理論。中醫學“有諸內必形諸外”等基礎理論已在中醫某些證候（寒熱證、脾虛證、腎陽虛證）上得到驗證。采用血、尿、糞等生物樣品，系統生物學從不同組學層面闡明了對應“群”“組”“譜”的調節規律與中醫辨證全身病理狀態間的相關性[14-17]。因此，基于系統生物學的中醫證候量化和現代化研究理論上可行[18]。

4 系統生物學與“證候”本質相關性研究

4.1 轉錄組學技術

轉錄組學是在特定時期和特定生理狀態下，挖掘整體水平上的細胞、組織的總數基因組質和量的表達和轉錄情況，并揭示其相關規律的一門學科[19]。從廣義層面來說，是指總數基因表達和轉錄的RNA總和，包括信使RNA（mRNA）和非編碼RNA（ncNRA），而在狹義層面則專門指編碼蛋白質的mRNA。Jiang等[20]采用Human LncRNA Microarray V3.0分析不同證候肺結核患者lncRNA表達譜，結果lncRNA表達存在差異的肺陰虛證有566個，氣陰兩虛證有60個，肝火傷陰證有55個（Fold change＞2，＜0.05）。KEGG通路分析提示差異表達基因關聯于Hippo信號通路和蛋白質的消化吸收。王階等[21]研究不穩定型心絞痛血瘀證候，以血塞通治療并觀察其對miR-146b-5p、miR-199a-5p及其富集的干預抗原呈遞和處理通路、p53信號通路和NK細胞介導的細胞毒性作用通路靶基因（KIR3DS1，HLA-DPB1，TP53SESN2，NCR1，PRF1）的影響，結果顯示miR-146b-5p、miR-199a-5p可作為診斷潛在生物標志物，且靶基因的變化提示上述3條信號通路可被miR-146b5、miR-199a-5p影響。廖江銓[22]采用高通量測序篩選冠心病血瘀證相關基因表達譜，從轉錄組學層面探索冠心病血瘀證的病理機制和證候本質，為研究冠心病血瘀證的生物標志物和活血化瘀的作用靶點提供客觀依據。

4.2 代謝組學技術

代謝組學是反映生物體代謝功能在疾病或藥物影響下所表現出的不同代謝模式的一門科學，其主要通過測定生物體各種不同體液內代謝產物的組成和變化來鑒定。血、尿、糞、唾液等是代謝組學的主要生物學樣本。代謝組學的核心就是代謝物的檢測、分析與鑒定，目前主要的技術手段包括核磁共振（NMR）、液相色譜-質譜聯用（LC-MS）、氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）等。陳德軒等[23]通過膠帶表皮剝脫加金葡菌菌液注射致大鼠瘡瘍模型，收集正常組與模型組大鼠血漿與尿液并進行代謝輪廓分析。結果顯示，主成分分析圖和正交偏最小二乘-判別分析圖均可看出實驗模型大鼠血漿、尿液圖譜與正常組大鼠圖譜存在差異，兩者明顯區分。馬琪[24]通過通過建立濕熱泄瀉大鼠模型，并運用白頭翁湯進行治療，運用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間-串聯質譜（UPLC-Q-TOF/MS）技術進行代謝組學檢測大鼠血和尿液的差異性代謝產物相關通路和篩選代謝標志物。結果顯示，共有7種差異性代謝產物和17種潛在的代謝標志物，白頭翁湯中有45個活性成分，作用靶點166個及相關疾病343種。提示白頭翁湯可能是通過調節濕熱泄瀉大鼠機體內血清生物標志物7-酮基脫氧膽酸、創傷酸和五羥色胺的含量，并通過調控血清甘油酯代謝、初級膽酸合成和色氨酸的代謝通路從而起到治療濕熱泄瀉的目的。王佳婕等[25]核磁共振氫譜（1H-NMR）定量檢測慢性復發型潰瘍性結腸炎（UC）虛、實證患者血漿代謝物含量。篩選出潛在生物標志物共10種，其中UC患者乙酰乙酸、丙酮水平明顯高于健康人，而肌肽、乳酸、異亮氨酸、丙氨酸則顯著低于健康者。慢性復發型UC患者血清中蘇氨酸、葡萄糖、肌肽表現為大腸濕熱證患者高于脾胃氣虛證患者，纈氨酸、丙氨酸及甘氨酸則在脾胃氣虛證患者較高。由此得出結論，慢性復發型UC虛、實證患者有較明顯的糖、氨基酸及脂質代謝紊亂，UC辨證分型有明顯的代謝物質基礎。Zhao等[26]運用UPLC-Q-TOF/MS技術研究不同證型（血瘀證和痰濁證）冠心病（CHD）患者，結果顯示，CHD及健康人有26種差異性代謝物（VIP＞1.5，＜0.5），這些代謝產物涉及與能量、氨基酸和炎癥等有關的代謝通路，而CHD血瘀證和痰濁證可由其中的19種差異性代謝產物辨證出來。羅朵生等[27]運用UPLC-Q-TOF/MS技術實時監測高脂血癥大鼠造模期間尿液代謝產物的改變，發現隨著造模時間的延長，模型組大鼠代謝產物構成出現明顯質的變化，表明這些代謝產物可能與高脂血癥密切相關，由此通過探索其差異性物質的變化進一步挖掘高脂血癥發病機制。Xie等[28]運用UPLC-Q-TOF/MS技術探索臨床健康者血清膽汁酸代謝譜，發現與膽汁酸代謝譜相關的影響因素有年齡、性別、體質量指數，由此得出臨床實踐中研究不同疾病的膽汁酸病理生理變化時應將這3個因素納入考慮范圍。張少強等[29]應用UPLC-Q-TOF/MS技術，分析CHD不同證型患者與健康人血漿中內源性小分子代謝物。結果顯示，與正常人比較，CHD不同證型患者存在檸檬酸、丙氨酸和組胺3種差異性代謝物質，其中丙氨酸和組胺代謝水平呈上升趨勢，而檸檬酸代謝水平呈下降趨勢。表明CHD患者存在脂肪酸代謝、氨基酸代謝和組胺代謝途徑的紊亂。西旺等[30]通過代謝組學研究方法觀察四物湯對自然衰老小鼠體內代謝物、代謝通路的影響，運用UPLC-Q-TOF/MS技術對小鼠血漿進行分析。表明四物湯影響自然衰老小鼠血漿中的代謝物是通過谷胱甘肽代謝、嘧啶代謝、精氨酸和脯氨酸代謝等途徑，從而改善小鼠衰老過程中的代謝紊亂，為該復方后續干預衰老物質基礎研究提供了生物學信息。

4.3 蛋白質組學技術

蛋白質組學是一門通過研究分析微觀的細胞、基因組或宏觀的組織所表達的生物體蛋白質構成及其變化規律的學科，以研究證候形成的物質基礎為前提條件，進一步分析整體蛋白質的表達水平，從中挖掘出證候的本質[31]。歐陽秋芳等[32]采用真武湯治療心腎綜合征陽虛水泛證患者，檢測治療前后血清蛋白質指紋圖譜，與健康對照組比較，真武湯干預后異常表達蛋白表達變為正常者視作陽虛水泛證標志性蛋白質。王端等[33]收集60例抽動障礙（TD）患兒（氣郁化火證34例、脾虛痰聚證26例）及30例健康兒童，檢測血清蛋白峰值，分析差異蛋白峰。結果顯示，TD組與健康對照組間差異蛋白峰8個，差異均有統計學意義（＜0.001）。2個差異蛋白峰存在于氣郁化火證與脾虛痰聚證患兒之間（＜0.001）。李依潔[34]采用TMT蛋白組學技術分析溫腎健脾法干預脾腎陽虛型腹瀉型腸易激綜合征大鼠結腸組織和海馬組織主要差異蛋白的變化。結果發現3個主要蛋白（Gsk3b、Wbp11和Tgm2）和3個次要蛋白（Acss2、Cox6b1和Mrpl12），并發現有6個信號通路的改變，分別為Metabolic pathways、Ribosome、Alzheimer disease、Oxidative phosphorylation、Huntington’s disease和Spliceosome。趙靜[35]應用iTRAQ標記蛋白組學技術分析比較單純高脂高糖喂飼以及高脂高糖喂飼聯合鏈脲佐菌素（STZ）的2型糖尿病大鼠模型中醫證候和血清蛋白組學特征。結果顯示，共有差異蛋白97個（上調37個、下調60個）、無明顯變化蛋白32個存在于高脂高糖組與高脂高糖聯合STZ組之間，差異蛋白涉及116條生物學途徑，13條存在顯著差異的信號通路，差異蛋白質相互作用網絡有2個；與高脂高糖組比較，高脂高糖聯合STZ組大鼠血清HSP71、PPKARIA、FXII、FCN2蛋白表達明顯上調，a1I3蛋白表達明顯下調，而UN13D、LBP蛋白表達未見顯著差異。劉雄等[36]采用同位素相對標記與TMT聯合2D-LC-MS/MS，篩選系統性紅斑狼瘡（SLE）合并激素性股骨頭壞死（SANFH）筋脈瘀滯證、肝腎虧虛證患者與健康人之間的血清差異蛋白質，共篩選出10個表達差異倍數在2倍以上顯著表達的蛋白質。其中IGHV3-7、IGHV1OR15-1、ABCB9、FGB、F13A1、FGG、FGA筋脈瘀滯組顯著表達；SAA1、ACTB、CRP肝腎虧虛組顯著表達。表明IGHV3-7、IGHV1OR15-1、ABCB9、FGB、F13A1、FGG、FGA可能是SLE合并SONFH筋脈瘀滯證潛在的血清特異性蛋白標志物，SAA1、ACTB、CRP可能是SLE合并SONFH肝腎虧虛證潛在的血清特異性蛋白標志物。

4.4 基因組學技術

基因組學是一門從整體層面對基因的多樣性、基因組的表達及功能、蛋白質產物的功能進行的明確闡釋，從而揭示生物體內所有基因之間的關系及所有基因在染色體上的結構、位置功能的學科。汪梅姣[37]基于基因芯片表達技術比較脾虛型痛風人群與正常人群之間的差異基因。結果顯示，研究組與正常組比較，509個基因表達上調，911個基因表達下調。提示脾虛型痛風患者體內與免疫系統有關的基因表達發生改變。汪洋[38]通過代謝組學層面研究類風濕關節炎（RA）脾虛證患者，其糞便代謝產物為脾虛證RA基因組學提供了研究基礎，并分析該表達譜的差異。結果顯示，差異表達基因共633條存在于脾虛型RA患者和健康人之間，其中上調和下調的基因分別有201條和432條，涉及25條基因功能和37條信號通路，主要參與炎癥、蛋白質代謝、神經內分泌免疫性疾病。孫丙銀等[39]采用基因組學分析70例激SANFH患者，經PCR-LDR檢測，得出SANFH“瘀”證與CYP1A2、G2964A結合位點AG＋GG基因型具有較大關聯性，而其結合位點的突變AA基因型是SANFH“虛”證發生的危險因素。翁莉等[40]以非肝腎陰虛患者作為對照組，研究肝腎陰虛證的基因表達譜并分析了差異表達基因。結果顯示，肝腎陰虛證較對照組存在差異基因表達特征圖譜，從基因組學角度進一步證實人體出現非正常狀態是由于基因在mRNA和/或蛋白質水平上發生改變而導致的。

5 小結

基因和蛋白質的變化提示機體狀態會如何轉變，而代謝物質和代謝表型反映的是當前的機體狀態，其直接展現了生物體系中機體的生理和生化功能狀態。“證候基因組譜”“證候蛋白質組譜”“證候轉錄組譜”“證候代謝組譜”的構建，為中醫證候的客觀化、標準化、量化及證候本質的相關研究提供了新的技術支持，因此，從系統生物學層面挖掘中醫證候本質已成為可能。

目前，基于系統生物學的思路和方法在中醫證候研究上雖已取得了一定成果，但由于絕大多數實驗研究手段采用單一的組學技術，而各組學在研究目的、內容及手段上不盡相同，導致難以深刻反映系統生物學在思路和技術上的整合性，因此，中醫證候研究尚未取得實質性的突破。應綜合各大組學技術開展研究，全面整合數據，建立證候的診斷模型，達到精確、量化地預測證候類型，為中醫證候的本質研究提供理論和實驗基礎。

[1] 張敏.傳統文化對中醫“證”理論形成的影響[J].河南中醫,2011, 31(8)：839-840.

[2] WANG X, ZHANG A, SUN H. Future perspectives of Chinese medical formulae：chinmedomics as an effector[J]. OMICS,2012,16(7/8)：414-421.

[3] 胡學軍,蔡光先,劉柏炎,等.蛋白質組學在中醫“證”實質研究中的應用[J].中華中醫藥雜志,2008,22(2)：87-91.

[4] 宋劍南.論中醫證候基礎研究的模式和方法[J].中國中醫基礎醫學雜志,2007,13(2)：81-83.

[5] 王永炎,張啟明,張志斌.證候要素及其靶位的提取[J].山東中醫藥大學學報,2006,30(1)：6-7.

[6] KITANO H. Foundations of systems biology[M]. London：MIT Press Camgbridge,MA,2001：10-11.

[7] 胡志峰,肖誠,何燕,等.系統生物學將會促進中醫藥學的發展[J].上海中醫藥雜志,2007,41(2)：1-4.

[8] 李曉紅,梁媛,李晶晶,等.系統生物學與中醫證本質研究[J].中國中醫基礎醫學雜志,2011,17(2)：211-212.

[9] 沈自尹.中西醫結合腎本質研究回顧[J].中國中西醫結合雜志, 2012,32(3)：304-306.

[10] 危北海,陳小野.脾氣虛證實質的初步揭示[J].中國中西醫結合脾胃雜志,1999,7(4)：193-195.

[11] 蔣躍絨,殷惠軍,劉穎,等.血瘀證基礎研究的若干思考[J].中國中醫基礎醫學雜志,2005,11(8)：561-563.

[12] HOOD L, HEATH J R, PHELPS M E, et al. Systems biology and new technologies enable predictive and preventative medicine[J]. Science,2004,306(5696)：640-643.

[13] AUFFRAY C, CHEN Z ,HOOD L. Systems medicine：The future of medical genomics and healthcare[J]. Genome Med,2009,1(1)：2.

[14] DAI J, SUN S, CAO J, et al. Similar connotation in chronic hepatitis B and nonalcoholic Fatty liver patients with dampness- heat syndrome[J]. Evid Based Complement Alternat Med,2013,2013：793820.

[15] LU C, XIAO C, CHEN G, et al. Cold and heat pattern of rheumatoid arthritis in traditional Chinese medicine： Distinct molecular signatures indentified by microarray expression profiles in CD4-positive T cell[J]. Rheumatol Int,2012,32(1)：61-68.

[16] 劉雅榮,李晶潔,呂書勤,等.基于核磁共振的脾虛濕盛證肝癌患者血漿代謝組學研究[J].世界科學技術－中醫藥現代化,2016,18(2)：296- 301.

[17] ZHAO H,CHEN J,SHI Q,et al. Metabolomics-based study of clinical and animal plasma samples in coronary heart disease with blood stasis syndrome[J]. Evid Based Complement Alternat Med,2012, 2012：638723.

[18] 謝世平,左剛.運用系統生物學研究中醫證候的思考仁[J].世界中醫藥,2011,6(5)：369-372.

[19] JACQUIER A. The complex eukaryotic transcriptome： unexpected pervasive transcription and novel small RNAs[J]. Nat Rev Genet, 2009,10(12)：833.

[20] JIANGT T, WEI L L, SHI L Y, et al. Microarray expression profile analysis of mRNAs and long non-coding RNAs in pulmonary tuberculosis with different traditional Chinese medicine syndromes[J]. Bmc Complem Altern Med,2016,16(1)：472.

[21] 王階,滕菲,劉詠梅,等.血塞通對冠心病不穩定型心絞痛血瘀證患者microRNA的干預作用[J].中國實驗方劑學雜志,2017,23(19)：11-16.

[22] 廖江銓.冠心病血瘀證相關lncRNA-miRNA-mRNA調控網絡研究[D].北京：北京中醫藥大學,2017.

[23] 陳德軒,蔡紅蝶,宿樹蘭,等.中醫病證相符的大鼠瘡瘍模型的建立及其血漿、尿液代謝組學研究[J].中醫藥學報,2019,47(1)：17-22.

[24] 馬琪.基于代謝組學和網絡藥理學的白頭翁湯治療濕熱泄瀉的作用機制研究[D].蘭州：甘肅農業大學,2018.

[25] 王佳婕,曹云,李中峰,等.基于核磁共振氫譜的慢性復發型潰瘍性結腸炎中醫虛、實證候血漿代謝組學研究[J].北京中醫藥大學學報,2018, 41(9)：787-792.

[26] ZHAO L, WAN L, QIU X, et al. A metabonomics profilings study on phlegm syndrome and blood-stasis syndrome in coronary heart disease patients using liquid chromatography/guadrupole time- of-flight mass spectrometry[J]. Evid Based Complement Alternat Med,2014,2014：385102.

[27] 羅朵生,李坤平,樸勝華,等.高脂血癥大鼠病程進展的尿液代謝組學的研究[J].廣東藥學院學報,2016,32(2)：224-227.

[28] XIE G X, WANG Y X, WANG X N, et al. Profiling of serum bile acids in a healthy Chinese population using UPLC-MS/MS[J]. J Proteome Res,2015,14(2)：850-859.

[29] 張少強,鞠靜,朱明丹,等.慢性心力衰竭不同證型的代謝組學研究[J].時珍國醫國藥,2019,30(2)：507-509.

[30] 西旺,閆起,王燕,等.基于中醫方證代謝組學分析四物湯對自然衰老小鼠的干預作用[J].中國實驗方劑學雜志,2019,25(12)：9-14.

[31] 王磊瓊,段新科,董寶剛.慢性乙型病毒性肝炎中醫虛證的蛋白質組學規律初探[J].光明中醫,2012,27(3)：458-459.

[32] 歐陽秋芳,郭鵲暉,連艷平,等.基于真武湯藥物反證的心腎綜合征陽虛水泛證血清蛋白組學研究[J].時珍國醫國藥,2016,27(10)：2555- 2557.

[33] 王端,賀莉,張婕,等.應用蛋白質組學技術篩選抽動障礙患兒不同中醫證型血清相關蛋白[J].中國婦幼健康研究,2018,29(2)：149-153.

[34] 李依潔.基于腦-腸互動溫腎健脾法干預腹瀉型腸易激綜合征的蛋白組學研究[D].北京：北京中醫藥大學,2017.

[35] 趙靜.基于蛋白組學技術對2型糖尿病大鼠病證模型特點及中藥復方干預作用的研究[D].北京：北京中醫藥大學,2016.

[36] 劉雄,曾平,秦剛,等.系統性紅斑狼瘡合并激素性股骨頭壞死中醫證型的血清差異蛋白質組學研究[J].中華中醫藥學刊,2018,36(11)：2662-2666.

[37] 汪梅姣.基于糞便上清代謝組學及基因組學探討脾虛型痛風的生物學特征[D].杭州：浙江中醫藥大學,2013.

[38] 汪洋.基于糞便上清代謝組學及基因組學探討類風濕關節炎脾虛證的生物學特征[D].杭州：浙江中醫藥大學,2013.

[39] 孫丙銀,趙寶祥,韋標方.激素性股骨頭壞死中醫證候與CYP1A2基因多態性的關聯研究[J].南京中醫藥大學學報,2015,31(3)：210-213

[40] 翁莉,杜鵑,何文婷,等.原發性肝癌肝腎陰虛證患者外周血單個核細胞的特征性差異基因[J].中西醫結合學報,2012,10(4)：406-415.

Research Progress in TCM Syndromes Based on Systems Biology

LU Dongxue1,2, LIU Feng3, YAN Jing1, SUN Zhiguang1

“Syndromes” have always been the core issue of research on TCM field, However, lack of objective and quantifiable indexes of TCM syndromes have restricted the development and modernization of TCM. Metabolomics, genomics, and proteomics constitute the main research contents of systems biology. Its soul lies in "integration", which is similar to the "holistic view" of TCM. Based on the nature of TCM syndromes in systems biology, the identification of TCM syndromes is more credible. This article systematically reviewed the research progress of systems biology in TCM syndromes.

systems biology; TCM syndromes; objectivity; holistic view; essence; metabolomics; genomics; proteomics; review

R2-05；R228

A

1005-5304(2020)06-0131-05

10.3969/j.issn.1005-5304.201904078

國家自然科學基金（81673795、81503536、81603578）

孫志廣，E-mail：pr_zhiguangsun@163.com

（2019-04-05）

（2019-04-29；編輯：華強）