魏海萍，郭 佳，葛朝明，邵康梅，王浩泰，盧 妮，王 歡*

(蘭州大學 1.第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科； 2.第二臨床醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730030)

缺血性卒中(ischemic stroke)發(fā)病率高，危害大，但治療措施有限[1]。缺血后神經(jīng)元的恢復與腦梗死的愈后相關(guān)[2]。微小RNAs(microRNAs, miRNAs)與靶信使RNA(mRNA)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平對靶蛋白進行負性調(diào)節(jié)[3]。有報道m(xù)iR-338-3p可通過靶蛋白調(diào)控細胞增殖、調(diào)亡[4]。但miR-338-3p與神經(jīng)元缺血方面的研究尚未見報道。

蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)屬于蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶家族，參與各類細胞內(nèi)生物事件，如細胞自噬[5]。其中cPKCγ只存在于腦和脊髓神經(jīng)元[6]。前期利用小鼠腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)小鼠和氧-糖剝奪(oxygen glucose deprivation，OGD)/復糖復氧(reoxgenation, R)神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)cPKCγ的激活發(fā)揮神經(jīng)保護作用[7]。已報道cPKCγ通過Akt-mTOR通路調(diào)節(jié)神經(jīng)元自噬減輕缺血性卒中鼠腦損傷[8]。基于此，本研究探討cPKCγ在腦缺血中與miR-338-3p的相關(guān)性，以及miR-338-3p對缺血神經(jīng)元存活率及死亡率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性SFP級C57BL/6J小鼠(體質(zhì)量為22～24 g)及C57BL/6J乳鼠[蘭州大學實驗動物中心,SCXK(甘)2018-0002號];miR-338-3p慢病毒(negative control, NC)(上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司)；兔源性cPKCγ多克隆抗體(Santa Cruze公司)；抗actin鼠源性單克隆抗體(Sigma-Aldrich公司)；MTT(噻唑蘭)試劑盒(Applichem公司)；ECL發(fā)光試劑盒(北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG抗體(北京中山金橋生物技術(shù)有限公司)；miRNA反轉(zhuǎn)錄以及熒光定量試劑盒(北京天根生化有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠及神經(jīng)元的分組及處理：將小鼠分為：對照組、假手術(shù)組、1 h MCAO/R 24、48和72 h組。MCAO/R用線栓阻塞大腦中動脈1 h，拔出線栓恢復血流，整個手術(shù)過程平均80 min內(nèi)完成。將神經(jīng)元分為：常氧組(normoxia group)、1 h OGD/R 0、6、12和24 h組。OGD/R方法：取24 h內(nèi)出生的乳鼠皮質(zhì)組織，制備好后種植，置37 ℃、通以5% CO2/95% O2混合氣體、飽和濕度的CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。將飼養(yǎng)液更換為無糖 DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、通有混合氣體(5% CO2，1% O2和 94% N2)的低氧箱內(nèi)，OGD 1 h，然后將無糖培養(yǎng)基更換為飼養(yǎng)液，置于5% CO2、95% O237 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。

將病毒感染神經(jīng)元分為：非轉(zhuǎn)染對照組(non-transfection)、轉(zhuǎn)染miR-338-3p前體組(pri-miR-338)、前體對照組(pri-miR-control)、轉(zhuǎn)染miR-338-3p抑制劑組(anti-miR-338)、抑制劑對照組(anti-miR-control)。神經(jīng)元培養(yǎng)至第3天，將構(gòu)建的病毒(MOI=20)按照分組加入飼養(yǎng)液中侵染72 h。

1.2.2 RT-qPCR)檢測cPKCγ及miR-338-3p mRNA水平：檢測各組的miR-338-3p和cPKCγ mRNA表達水平。cPKCγ mRNA的檢測方法如下：提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列如下：miR-338-3p： 5′-UUUGCGGAAUUUUAAAUGCUGGA-3′，3′-GUUG UUUUAGUGACUACGACCU-3′；cPKCγ上游引物：5′-GGAATTGTATGAGGTAATGCTGGC-3′，下游引物：5′-AATCGCCCCCAGTGACATAC-3′。

檢測方法如下：提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以U6為內(nèi)參照。進行PCR擴增。獨立重復實驗3次，每次3個復孔。

1.2.3 Western blot檢測蛋白：MCAO小鼠腦組織和OGD神經(jīng)元制備成電泳樣品，制備好的蛋白樣品進行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜封閉，抗cPKCγ(1∶2 000)和actin(1∶5 000)抗體4 ℃孵育，辣根過氧化物酶(HRP)標記Ⅱ抗(1∶10 000)中孵育，ECL發(fā)光法顯影曝光。

1.2.4 噻唑蘭(MTT)比色法和乳酸脫氫酶(LDH)測定神經(jīng)元活性：MTT：酶標儀來測定490 nm波長的吸光度值(A490)。正常對照組的細胞存活率為100%作為對比，OGD組細胞存活度(%)=OGD組吸光度值(A)值/對照組A值×100%。LDH：采用CytoTox96非放射性細胞毒性檢測試劑盒進行LDH的測定。使用酶標儀在490 nm測量吸光度值。

1.2.5 免疫熒光和高內(nèi)涵檢測神經(jīng)元凋亡情況: 將培養(yǎng)成功神經(jīng)元(或經(jīng)OGD處理)，加入含有incuCyte caspase-3 reagents的常規(guī)飼養(yǎng)液體，置于高內(nèi)涵儀器活細胞模塊5% CO2/21% O2/74% N2條件下復氧并實時成像，每隔2 h拍照1次，每個孔拍10個視野，計數(shù)綠色熒光細胞個數(shù)與培養(yǎng)板孔底面積的比例并繪制曲線。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 cPKCγ蛋白水平在MCAO致小鼠腦梗死區(qū)周圍皮質(zhì)和OGD致神經(jīng)元中表達均顯著上調(diào)

1 h MCAO/R 24、48和72 h小鼠腦梗死區(qū)周圍皮質(zhì)cPKCγ蛋白水平較對照組顯著升高(P<0.001) (圖1A,C)；1 h OGD/R 0、6、12和24 h神經(jīng)元cPKCγ蛋白水平較對照組顯著升高(P<0.001)(圖1B,D)。

2.2 cPKCγ mRNA水平在MCAO致小鼠腦梗死區(qū)周圍皮質(zhì)和OGD致神經(jīng)元中表達均顯著上調(diào)，且miR-338-3p可能調(diào)控cPKCγ的表達

1 h MCAO/R 24、48和72 h小鼠腦梗死區(qū)周圍皮質(zhì)cPKCγ mRNA水平明顯增高(P<0.001)(圖2A), 在1 h OGD/R 0、6、12和24 h神經(jīng)元內(nèi)cPKCγ mRNA水平也明顯增高(P<0.001)(圖2B)。生物信息學網(wǎng)站TargetScanHuman預測發(fā)現(xiàn)，cPKCγ(PRKCG)3′UTR存在1個miR-338-3p結(jié)合位點，且該結(jié)合位點在多個物種中是保守的(圖3)。這提示，miR-338-3p可能參與調(diào)控cPKCγ的合成。

A,B.typical results of Western blot showed cPKCγ protein levels in MCAO-treated peri-infarct cortex of mice and OGD-treated neurons; C.quantitative analysis demonstrated that cPKCγ protein level significantly increased in peri-infarct cortex of mice for 1 hour MCAO/R 24, 48 and 72 hours; D.quantitative analysis demonstrated that cPKCγ protein level significantly increased in neurons for 1 hour OGD/R 0, 6, 12 and 72 hours;*P<0.001 compared with sham or normoxia group

圖1 MCAO處理小鼠腦梗死區(qū)周圍皮層和OGD處理神經(jīng)元中cPKCγ蛋白表達量變化

2.3 miR-338-3p在MCAO處理小鼠腦梗死區(qū)周圍皮質(zhì)和OGD處理神經(jīng)元中顯著下調(diào)，且miR-338-3p與cPKCγ mRNA表達水平呈負相關(guān)

1 h MCAO/R 24、48和72 h小鼠腦梗死區(qū)周圍皮質(zhì)miR-338-3p mRNA水平明顯下降(P<0.001) (圖4A)，在1 h OGD/R 0、6、12和24 h神經(jīng)元內(nèi)miR-338-3p mRNA水平也明顯下降(P<0.001) (圖4B)。miR-338-3p與cPKCγmRNA水平表達呈負相關(guān)。

A.RT-qPCR results showed that cPKCγ mRNA level significantly increased inperi-infarct cortex of mice for 1 hour MCAO/R 24, 48 and 72 hours; B.RT-qPCR results showed that cPKCγ mRNA level significantly increased in neurons for 1 hour OGD/R 0, 6, 12 and 72 hours;*P<0.001 compared with sham or normoxia group

圖2 MCAO處理小鼠腦梗死區(qū)周圍皮質(zhì)和OGD處理神經(jīng)元中cPKCγ mRNA水平變化

圖3 miR-338-3p與cPKCγ 3′UTR結(jié)合序列

A.RT-qPCR results showed that miR-338-3p mRNA level significantly increased in peri-infarct cortex of mice for 1 hour MCAO/R 24, 48 and 72 hours; B.RT-qPCR resultsshowed that miR-338-3p mRNA level significantly increased in neurons for 1 hour OGD/R 0, 6, 12 and 72 hours;*P<0.001 compared with sham or normoxia group

圖4 miR-338-3p mRNA水平在MCAO處理小鼠腦梗死區(qū)周圍皮質(zhì)和OGD處理神經(jīng)元中變化

2.4 miR-338-3p對OGD致缺血神經(jīng)元損傷程度的影響

過表達miR-338-3p可使1 h OGD/R 24 h神經(jīng)元存活率下降(P<0.001)(圖5A)，凋亡率上升(P<0.001)(圖5B)，caspase-3蛋白平均熒光強度值顯著增高(P<0.001)(圖5D)，而抑制miR-338-3p表達會使1 h OGD/R 24 h神經(jīng)元存活率上升(P<0.001) (圖5A)，調(diào)亡率下降(P<0.001) (圖5B)，caspase-3蛋白平均熒光強度值顯著降低(P<0.001)(圖5C,D)。

A.RT-qPCR results showed that the neuronal survival rate decreased in pri-miR 338 group, and the neuronal survival rate increased in anti-miR-338 group; B.RT-qPCR results showed that the neuronal death rate increased in pri-miR-338 group, and the neuronal death rate decreased in anti-miR-338 group；C.typical results of immunofluorecence and HCA results showed the mean fluorescence intensity of caspase-3(×40); D.quantitative analysis demonstrated that the mean fluorescence intensity of caspase-3 increased in pri-miR-338 group and decreased in anti-miR-338 group；*P<0.001 compared with normoxia group;#P<0.01,##P<0.001 compared with non-trans group

圖5 過表達或抑制miR338-3p后神經(jīng)元存活率和凋亡率

3 討論

cPKCγ是神經(jīng)元特有蛋白，在腦缺血病理生理機制中發(fā)揮重要的作用。PKC磷酸化水平與缺血再灌注損傷程度相關(guān)，通過抑制PKC磷酸化水平減輕缺血/再灌注損傷[8]，說明PKC磷酸化水平?jīng)Q定了它的活性和功能。對于PKC的激活，也有不同的報道， PKC激活與其發(fā)生膜轉(zhuǎn)位程度有關(guān)。報道cPKCγ通過Akt-mTOR通路調(diào)節(jié)神經(jīng)元自噬減輕腦缺血損傷[9]，但其調(diào)控機制不詳。本研究結(jié)果顯示，cPKCγ蛋白水平及mRNA水平在MCAO小鼠腦梗死區(qū)周圍皮質(zhì)和OGD致神經(jīng)元中顯著表達上調(diào)。

miRNA 做為一類非編碼RNA，可調(diào)控機體許多生理和病理過程，調(diào)控大約30%的編碼蛋白基因[10]。miR-338-3p在多種疾病中表達下調(diào)，miR-338-3p下調(diào)促進骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織纖維化[11]。對于miR-338-3p表達上調(diào)的報道多見于對腫瘤研究。有報道m(xù)iR-338-3p表達上調(diào)發(fā)揮抑癌基因作用，其表達下調(diào)可能會使前列腺癌患者臨床預后不良[12]。miR-338-3p表達上調(diào)，通過下調(diào)低氧誘導因子抑制鼻咽癌瘤細胞的遷移和擴散[13]。本研究結(jié)果顯示，miR-338-3p可能參與調(diào)控cPKCγ的合成。為了驗證miR-338-3p可能負調(diào)控cPKCγ的合成，在離體細胞水平，得出miR-338-3p在MCAO小鼠腦梗死區(qū)周圍皮質(zhì)和OGD致神經(jīng)元中顯著下調(diào)表達，且miR-338-3p與cPKCγ mRNA水平表達呈負相關(guān)。另外，在離體細胞實驗得出，過表達miR-338-3p會加重OGD致缺血神經(jīng)元損傷程度，而抑制miR-338-3p表達會減輕OGD致缺血神經(jīng)元損傷程度。miR-338-3p通過負調(diào)節(jié)cPKCγ而減輕缺血性卒中腦損傷。以上結(jié)果說明腦缺血后miR-338-3p表達下調(diào)起到保護神經(jīng)元免受缺血損傷作用，其機制可能與miR-338-3p致cPKCγ蛋白水平上調(diào)有關(guān)。

總之，本研究表明，miR-338-3p與cPKCγ mRNA水平表達呈負相關(guān)，miR-338-3p通過負調(diào)節(jié)cPKCγ而減輕缺血性卒中腦損傷。