枇杷果實中NAD MDH基因克隆及植物表達載體構建

寇燕 楊俊 高歡歡 陳旭 郭傲 鄭國華

摘?要：為探索枇杷果實中蘋果酸的積累與降解機制，從枇杷果實轉錄組中得到NAD?MDH的開放閱讀框的基因序列。以枇杷高酸品種解放鐘和低酸品種白梨為材料，提取果實中總RNA，運用RT?PCR技術克隆出枇杷果實中蘋果酸合成酶基因NAD?MDH，并進行熒光定量PCR分析。結果表明：枇杷果實中蘋果酸合成酶基因NAD?MDH的開放閱讀框（ORF）為996 bp，共編碼了332個氨基酸。經熒光定量PCR分析，解放鐘和白梨在花期后95 d時NAD?MDH基因表達量最高;花后80～105 d，NAD?MDH基因在高酸與低酸品種間存在顯著差異。采用無縫克隆技術成功構建了植物表達載體EjNAD?MDH?PBI121，并導入根瘤農桿菌EHA105中得到植物轉化工程菌，為后期利用轉基因技術改良枇杷果實品質及遺傳改良打下基礎。

關鍵詞：枇杷;NAD?MDH基因;基因克隆;表達分析;載體構建

中圖分類號：S667.3?文獻標志碼：A?文章編號：0253-2301（2020）04-0001-08

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.04.001

Cloning of NAD?MDH Gene in Loquat Fruit and the Construction of Plant Expression Vector-

KOU Yan， YANG Jun， GAO Huan?huan， CHEN Xu， GUO Ao， ZHENG Guo?hua*

（College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University/Institute of Storage Science and Technology ofHorticultural Products， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China）

Abstract： In order to explore the accumulation and degradation mechanism of malic acid in loquat fruit， the gene sequence of the open reading frame of NAD?MDH was obtained from the transcriptome of loquat fruit. By taking Jiefangzhong （the high?acid variety of loquat） and Baili （the low?acid variety of loquat） as the materials， the total RNA was extracted from the fruit， and the NAD?MDH gene of malate synthetase in loquat fruit was cloned by RT?PCR， and then the fluorogenic quantitative PCR analysis was conducted. The results showed that the open reading frame （ORF） of the NAD?MDH gene of malate synthetase in loquat fruit was 996 bp， encoding 332 amino acids. The fluorescence quantitative PCR analysis showed that the gene expression of NAD?MDH was the highest in Jiefangzhong and Baili at 95 d after flowering， while the NAD?MDH gene showed significant difference between the high?acid and low?acid varieties at 80-105 d after flowering. The plant expression vector EjNAD?MDH?PBI121 was successfully constructed by the seamless cloning technology， and then was introduced into the agrobacterium tumefaciens EHA105 to obtain the engineering bacteria for plant transformation， which laid a foundation for the later use of transgenic technology to improve the quality and genetic improvement of loquat fruit.

Key words： Loquat; NADMDH gene; Gene cloning; Expression analysis; Vector construction

枇杷是我國的原產果樹，其產量、面積均居世界第一[1]。枇杷果肉柔軟多汁，風味獨特，并且具有潤肺、 止渴等作用，一直以來都深受人們喜愛。枇杷果實成熟時期在春末夏初，此時正值水果淡季，因此具有較強的市場競爭力[2]。枇杷果實酸度偏高是影響其效益的主要問題，果實中有機酸的種類及質量分數是影響果實品質的重要因素之一[3]。根據水果果實在成熟過程中有機酸的積累可以分為3種類型：檸檬酸型、蘋果酸型、酒石酸型，枇杷果實屬于蘋果酸型的水果[4]。雖然枇杷果實中調控酸性的性狀基因是一對主效基因（Ma/ma），但其果實中蘋果酸的積累還需要通過蘋果酸代謝來實現，cyNAD?MDH基因是調控蘋果酸合成途徑的關鍵基因[5]。王鵬飛[6]從歐李果實的轉錄組中克隆出MDH基因，其研究結果表明MDH基因表達量差異是高低酸品種間蘋果酸積累差異的重要原因之一。姚玉新等

[7]克隆出蘋果果實中的cyMDH基因，并且通過原核表達鑒定其功能。任磊等[8]等已成功克隆得到牡丹的PsMDH基因，成功構建正義植物表達載體。但對于枇杷果實中cyNAD?MDH基因的克隆及載體構建仍然未見報道。本試驗采用RT?PCR技術克隆出NAD?MDH基因的ORF，并且通過生物信息學工具分析NAD?MDH基因的序列特征。利用qRT?PCR技術對枇杷高酸品種解放鐘和低酸品種白梨果實不同發育階段的表達量進行檢測，分析兩品種之間基因表達量的差異。采用無縫克隆技術構建植物表達載體EjNAD?MDH?PBI121導入農桿菌EHA105中，獲得轉基因菌株，旨在為鑒定NAD?MDH基因的功能提供參考，同時也為進一步研究枇杷果實中調控蘋果酸代謝基因及遺傳改良提供基礎。

1?材料與方法

1.1?試驗材料和試劑

供試枇杷果實采自莆田市常太鎮果園，枇杷樹為10年生，選取盛花期一致的解放鐘和白梨2個枇杷品種各3株，從幼果直至成熟，每隔2周采樣1次，每次兩個品種各采30個果實。采后迅速去皮用錫箔紙包好于液氮中速凍，保存于-80℃冰箱中以備提取RNA。

RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒及質粒快速提取試劑盒均購于天根生化科技（北京）有限公司;In?Fusion HD Cloning kits、Xba I和Sca I限制性內切酶、PrimeScript TMRT reagent Kit With gDNA Eraser、SYBR○RPremix Ex TapTM購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司;農桿菌EHA105、大腸桿菌（Esherichia coli）DH5α感受態細胞和HiFi酶、dNTP等均購自北京全式金生物技術有限公司;pBI121載體由本實驗室提供，所有引物由華大基因生物有限公司合成。

1.2?試驗方法

1.2.1?枇杷果實RNA提取和cDNA合成?嚴格按照天根多糖多酚植物總RNA提取試劑盒的說明書進行操作，采用1%瓊脂糖凝膠電泳和Thermo Scientific Nano Drop 2000c檢測提取RNA質量和濃度。以枇杷果實總RNA為模板，利用PrimeScriptTM RT reagent Kit With gDNA Eraser合成cDNA。

1.2.2?EjNAD?MDH基因克隆?根據已有枇杷RNA?seq數據庫篩選得到NAD?MDH基因保守區的核苷酸序列，設計NAD?MDH基因引物（表1），取逆轉錄產物1 μL為模板，建立25 μL如下PCR反應體系：10×Ex?Taq Buffer 2.5 μL;dNTP Mixture（10 mmol·L-1）0.5 μL;上、下游引物（10 mmol·L-1）各0.5 μL;cDNA模板，1 μL;Ex?Taq（5 U·μL-1），0.3 μL，加ddH2O至25 μL。按照如下擴增程序進行：94℃預變性5 min;循環35個（94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸60 s）;72℃ 8 min。PCR產物經膠回收純化后連接到pUCm?T載體上，用通用引物M13進行菌液PCR檢測，篩選正確的陽性克隆子送深圳華大基因生物有限公司測序。

1.2.3?果實發育過程中EjNAD?MDH基因的表達分析?以轉錄組中的Actin為內參基因，分別設計內參基因和目的基因熒光定量引物為Actin?F和Actin?R、QMDH?F和QMDH?R（表1），使用植物多糖多酚RNA提取試劑盒提取枇杷果實不同成熟期的RNA， 參照PrimeScriptTM RT reagent kit（Perfect Real Time）試劑盒的方法合成cDNA。實時定量 PCR 體系按照TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TapTM Ⅱ試劑盒說明書進行，反應參數為95℃30 s，1個循環;95℃5 s，60℃20 s，45個循環，每個樣品設3次生物重復和3次技術重復。以actin為內參基因，對枇杷在不同發育時期的表達量進行分析。

1.2.4?生物信息學分析?使用DNAMAN軟件比對和拼接氨基酸序列;利用Pfam 26.0（http：//pfam.sanger.ac.uk）和NCBI中Conserved Domains（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）程序進行蛋白保守域結構預測。利用PredictProtein在線軟件（http：//www.predictprotein.org/）進行蛋白質二級結構預測;利用 SWISS?MODEL在線軟件（http：//swissmodel.expasy.org/）進行蛋白質三維結構預測。

1.2.5?NAD?MDH基因的植物表達載體構建?采用 In?Fusion同源重組技術構建植物表達載體。利用snapgene軟件在NAD?MDH基因的引物5′端添加與載體同源15 bp且含有酶切位點的上下游引物，引物序列見表1。分別使用Xba I和Sca I限制性內切酶酶切pBI121質粒，按照酶切體系：pBI121質粒8 μL、Xba I 1 μL、Sca I 1 μL、10×buffer 2 μL、ddH2O 8 μL，混勻后37°酶切過夜，獲得含有Xba I和Sca I酶切位點的pBI121線性質粒。使用質粒快速

提取試劑盒提取對1.2.2中的菌液進行質粒提取，以提取的質粒為模板，使用帶有同源15 bp的引物對其進行擴增，PCR條件與程序同1.2.2，對目的基因片段進行膠回收。將帶有同源15 bp的NAD?MDH基因片段與載體線性片段進行連接體系：線性PCR產物3 μL、線性載體1 μL、5X In?Fusion HD Enzyme Premix 2 μL、ddH2O 4 μL。取2.5 μL的反應液轉化到DH5α感受態細胞，并涂布在含有Kanna的LB板，37℃過夜培養，挑去單菌落進行PCR并送華大基因生物有限公司測序。

2?結果與分析

2.1?枇杷果肉總RNA的提取

枇杷果肉總RNA經1%的瓊脂糖電泳檢驗其完整性，結果如圖1。從圖1可以看出，RNA條帶完整，18S和28S主條帶清晰，且無DNA的污染，表明提取的總RNA質量良好，可用于后續反轉錄合成質量較好的cDNA。

2.2?枇杷NAD?MDH基因的ORF克隆

以枇杷果實中的RNA為模板，設計1對引物MDH?F和MDH?R為上下游引物進行PCR擴增，獲得了與預期片段大小一致約996 bp條帶（圖2），將PCR產物回收并進行連接轉化，挑取白色菌落進行PCR鑒定，將鑒定為陽性的3個克隆子送華大基因生物有限公司測序，測序結果表明克隆的EjNAD?MDH基因ORF為996 bp，編碼332個氨基酸（圖3），利用NCBI中Blast對序列進行同源檢索，表明此序列與其他已登陸的蘋果、李、梨的NAD?MDH基因同源性高達95%～100%，將該基

2.3?EjNAD?MDH基因編碼的蛋白質的生物信息

利用ProtParam程序（https：//web.expasy.org/protparam/）翻譯所得NAD?MDH基因序列，得到的結果為NAD?MDH基因共編碼332個氨基酸殘基，理論上的蛋白分子量35.61 kD，理論等電點為6.01，分子式為C1573H2533N433O478S14。其中，負電荷殘基數為36個，正電荷殘基數為32個，枇杷NAD?MDH蛋白的不穩定系數為33.08（<40），屬于穩定蛋白。EjNAD?MDH基因編碼蛋白的疏水性分析結果表明，疏水性最大值為1.800，最小值為-2.891，其大部分區域為親水區（圖4A）。采用NCBI數據庫BLAST對編碼蛋白結構域進行預測，得出MDH基因與其家族基因具有很高的特征序列（圖4B），對于MDH蛋白進行二級結構預測時采用了SOPMA程序，其結果表明NAD?MDH基因主要由α螺旋、β轉角、延伸鏈、無規則卷曲四者組成，所占比例分別為45.18%、4.52%、16.87%和33.43%（圖4C）。采用swissmodel對NAD?MDH蛋白的三級結構進行預測，表明與4mdhB模型相似度高達80%（圖4D）。

2.4?EjNAD?MDH蛋白質的氨基酸同源性及系統發育分析

將NAD?MDH基因編碼的氨基酸提交到NCBI中的blast與薔薇科植物的NAD?MDH基因編碼的蛋白質進行比對分析（圖5），結果表明枇杷NAD?MDH蛋白與薔薇科的植物蘋果、歐李、白梨等的同源性高達80%以上。在同源性的基礎上運用MEGA 7軟件構建系統進化樹（圖6），可以看出枇杷與蘋果、白梨、歐李、甜櫻桃等親緣關系較近，但與番茄和胡楊關系較遠。

2.5?NAD?MDH基因植物表達載體的構建

分別使用Xba I和Sca I限制性內切酶酶切檢測正確的質粒PBI121，產物經過1%的瓊脂糖凝膠電泳后表明酶切成功（圖7），回收PBI121的線性片段，按照In?Fusion試劑盒的操作說明將質粒的線性片段與帶有同源15 bp的目的基因進行基因重組，對轉化后的菌液進行PCR檢驗，與預期結果一致，得到996 bp的片段（圖8），送華大基因生物有限公司進行檢測，結果序列正確，表明載體EjNAD?MDH??PBI121構建成功。

2.6?NAD?MDH基因的定量表達分析

利用熒光定量對枇杷果實生長發育過程中的NAD?MDH基因進行定量分析，由圖9可知，解放鐘和白梨果實中NAD?MDH基因表達量有著相似的趨勢，均呈現先升高降低再升高降低的趨勢。解放鐘NAD?MDH基因的表達量較白梨的波動趨勢大，兩者都呈現鋸齒狀波動。在盛花期后95 d NAD?MDH基因在兩個枇杷品種中的表達量最高，分別為7.14和3.82;在花后80 d之后解放鐘NAD?MDH的表達量明顯高于白梨的表達量。

3?討論

植物細胞中含有多種類型的蘋果酸合成酶如NAD?MDH和NADP?MDH等，其中NAD?MDH主要參與三羧酸循環，是蘋果酸代謝過程中合成蘋果酸的關鍵酶之一[9]。近年來，前人對薔薇科果樹的MDH基因進行了廣泛的研究。Yao等[10]從蘋果果實克隆了cyMDH基因的全長，其保守序列996 bp，編碼了332個氨基酸，并且通過轉基因技術驗證了MdMDH與蘋果酸的合成有著密切的聯系。田麗[11]從郁李的果實中分離克隆出NAD?MDH基因的保守序列872 bp，與蘋果、桃的MDH基因相似性為98%和95%。本研究從枇杷果實轉錄組數據中篩選出EjNAD?MDH家族中表達量較高的EjNAD?MDH基因，運用RT?PCR技術克隆EjNAD?MDH基因的保守區序列長度為996 bp，編碼了332個氨基酸，蛋白分子量為35.61 kD，理論等電點為6.01，分子式為C1573H2533N433O478S14。EjNAD?MDH蛋白屬于親水性蛋白。通過進化樹分析，EjNAD?MDH基因與其他物種的同源性很高，表明EjNAD?MDH基因在進化上具有高度的保守性[12]。

利用熒光定量PCR對2個枇杷果實的NAD?MDH基因在發育階段的表達進行檢測，采用Livak等[13]的2-ΔΔCT的方法對結果進行分析，結果表明高酸和低酸枇杷品種的NAD?MDH基因表達量具有相似的波動趨勢，兩個品種在花后（即果實成熟前）50～80 d時NAD?MDH基因的表達量很低，花后95 d（即果實成熟時）兩個品種的基因表達量達到最高，果實成熟后表達量降低但波動趨勢小。高酸（解放鐘）枇杷的NAD?MDH基因在果實發育過程中的表達量與低酸（白梨）枇杷的表達量存在顯著差異，表明NAD?MDH基因在兩個品種酸度差異中起到重要的調控作用。

將分離克隆的目的基因轉化到宿主基因組中，是基因工程的一項基本技術。植物表達載體是將目的基因轉化宿主細胞的重要媒介，載體構建是通過遺傳轉化方法開展基因功能鑒定的重要環節[14]。分析不同載體構建的方法，表明現在的主流構建載體的方式是Gateway技術，預測未來載體構建的發展趨勢將是無酶連接[15-19]。韓凱等[19]對傳統的構建方法、Gateway和采用無縫克隆構建載體的技術進行分析，從操作步驟、成本和時間等多方面進行綜合比較，表明采用無縫克隆技術構建的方法具有更高的優勢。本研究使用無縫克隆技術[20]，成功構建了EjNAD?MDH?PBI121表達載體，并采用凍溶法將表達載體轉化到農桿菌EHA105中。下一步將攜帶EjNAD?MDH?PBI121的農桿菌轉入番茄等作物，為進一步研究EjNAD?MDH基因的功能奠定基礎。

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（責任編輯：林玲娜）