新冠病毒SARS-CoV-2 檢測方法研究進(jìn)展

王淑燕，李 娜，張欣悅，王 強

（1.蘭州大學(xué)功能有機(jī)分子化學(xué)國家重點實驗室化學(xué)化工學(xué)院，蘭州730000；2.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，成都610227）

0 引 言

自2019 年新冠肺炎出現(xiàn)以來，疫情已波及全球100 多個國家，截至2020 年5 月8 日，全球范圍內(nèi)已有累計確診新冠肺炎病例3 767 744 例，累計死亡病例259 593 例。該病作為一種急性呼吸道傳染病已列入《中華人民共和國傳染病預(yù)防法》所規(guī)定的乙類傳染病，按照甲類傳染病管理，由新冠病毒所引起的肺炎，主要通過呼吸道飛沫傳播和人體密切接觸傳播，長期存在于密閉性較好的環(huán)境中則可通過氣溶膠傳播，人群普遍易感染，具有乏力、干咳、發(fā)熱等主要感染特征，潛伏期1 ～14 d，大多為3 ～ d 天［1］，國際病毒分類委員會（ICTV）將此新型冠狀病毒正式命名為SARS-CoV-2，此前該病毒被世衛(wèi)組織暫時命名為2019-nCoV。SARS-CoV-2 是迄今為止人類發(fā)現(xiàn)的第7 種可以感染人體的冠狀病毒，其他6 種分別為HCoV-229E、HCoVNL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV 和MERSCoV［2-3］，SARS-CoV-2 病毒臨床特征不顯著，傳染性強且感染人群多，在疫情防控及臨床治療中面臨著極大的困難，研發(fā)操作簡易、測量快速的檢測手段刻不容緩，因此，各醫(yī)院及各研發(fā)團(tuán)隊陸續(xù)用不同的方法研制出多種新冠病毒檢測試劑盒，從而達(dá)到快速檢測的目的。而新冠病毒和SARS病毒全基因組水平的高度同源性［4］也為試劑盒的設(shè)計提供了幫助，新冠病毒是一種RNA 病毒，試劑盒檢測原理通常是逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）達(dá)到擴(kuò)增病原體的核酸（RNA）的目的，并通過熒光等發(fā)光物質(zhì)作為探針對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實時檢測。現(xiàn)有多個科研機(jī)構(gòu)已公布了新冠病毒的基因組序列［5］，并已用于檢測試劑盒的研制。本文首先介紹了新冠病毒SARS-CoV-2 結(jié)構(gòu)及與生物體的作用機(jī)理，其次詳細(xì)介紹了各種病毒檢測方法，最后對當(dāng)前檢測方法存在的問題及可能改進(jìn)之處進(jìn)行了總結(jié)與展望。

1 新冠病毒SARS-CoV-2 結(jié)構(gòu)及與生物體的作用機(jī)理

SARS-CoV-2 冠狀病毒為β 屬有包膜的單股正鏈RNA病毒，直徑在60 ～140 nm，顆粒為圓形或橢圓形，常為多形性［1］，因病毒包膜具有可以向四周延伸的凸起，形似花冠，故得名為冠狀病毒（見圖1）。冠狀病毒主要通過核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N）、小包膜蛋白（envelope protein，E）、刺突表面糖蛋白（spike protein，S）和基質(zhì)蛋白（matrix protein，M）組成。其中S蛋白易與細(xì)胞結(jié)合并促進(jìn)病毒的遺傳物質(zhì)侵入受體細(xì)胞［6］，而N蛋白在病毒的轉(zhuǎn)錄中起一定的作用。

圖1 （a）新型冠狀病毒武漢株02（C-F13-nCoV Wuhan strain 02），NPRC 2020.00002 的透射電子顯微鏡結(jié)構(gòu)［7］（經(jīng)許可復(fù)制，Copyright? 2020 中國國家病原微生物資源庫，中國國家微生物科學(xué)數(shù)據(jù)中心），（b）SARS-CoV-2 的結(jié)構(gòu)示意圖（經(jīng)許可復(fù)制，Copyright? 2020 Centers for Disease Control and Prevention，the United States）

2020 年，Wrapp研究組用冷凍電鏡技術(shù)揭示新冠病毒表面S 蛋白三維結(jié)構(gòu)［8］，且對S 蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，如圖2（a）、2（b）所示，發(fā)現(xiàn)其受體結(jié)合域（receptor-binding domain，RBD）通過上下移動的方式來決定是否與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，即向上時S 蛋白可以通過RBD與受體結(jié)合，使得細(xì)胞膜與病毒包膜相互融合，細(xì)胞中因侵入病毒的遺傳物質(zhì)而被感染，而向下時結(jié)合部位則會隱藏。

圖2 （a）RBD 朝下、（b）RBD 朝上［8］及（C）冷凍電鏡下ACE2 的三維結(jié)構(gòu)［9］（經(jīng)許可復(fù)制，Copyright? 2020 the American Association for the Advancement of Science）

為了進(jìn)一步對冠狀病毒識別，Yam R［9］等也通過冷凍電鏡技術(shù)首次成功解析出細(xì)胞表面受體-血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）的全長結(jié)構(gòu)［見圖2（c）］，其為多數(shù)冠狀病毒入侵生物體的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。Walls，A. C.等人對SARS 病毒（SARS-CoV）及新冠病毒（SARS-CoV-2）S 蛋白的結(jié)構(gòu)、序列及功能等多方面進(jìn)行比較，證明新冠病毒入侵宿主細(xì)胞的機(jī)制和SARS 病毒相似，即病毒的S 蛋白利用細(xì)胞表面的ACE2 進(jìn)入受體［10］，這和Munster 組通過實驗證明的ACE2 是SARS-CoV-2 的功能受體結(jié)果一致［11］。Rao 等［12］報道了新冠病毒RNA 依賴性RNA聚合酶（RdRp）的結(jié)構(gòu)，作為具有潛力的藥物靶點，RdRp結(jié)構(gòu)的成功解析，為新冠病毒的治療提供了基礎(chǔ)。

準(zhǔn)確解析出新冠病毒S 蛋白、ACE2 受體及藥物靶點的三維結(jié)構(gòu)，揭示病毒的作用機(jī)理，對進(jìn)一步研制疫苗或設(shè)計有效的治療方案具有指導(dǎo)性意義。

2 檢測方法

新冠病毒的主要檢測方法包括抗原抗體、測序、PCR、CRISPR以及其他的一些檢測技術(shù)并制成便于攜帶的檢測試劑盒。截至2020 年4 月22 日，國家藥品監(jiān)督管理局共批準(zhǔn)新冠病毒核酸檢測試劑19 個，抗體檢測試劑11 個。需要說明的是：鑒于抗體檢測試劑方法學(xué)特點，產(chǎn)品僅用作對新型冠狀病毒核酸檢測陰性疑似病例的補充檢測指標(biāo)或疑似病例診斷中與核酸檢測協(xié)同使用，不作為新型冠狀病毒感染的肺炎確診和排除的依據(jù)，不適用于一般人群的篩查，僅限醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用。不僅中國的新冠病毒檢測試劑盒在不斷的更新進(jìn)步，國外一些研究機(jī)構(gòu)的研究成果也促進(jìn)了檢測技術(shù)的快速發(fā)展，如德國分子診斷公司Qiagen 使用床邊分子檢測（Molecular Point-of-Care）技術(shù)，僅需1 h就可以完成測試；美國的雅培公司研制出的“ID NOW”新冠病毒核酸檢測產(chǎn)品，稱其能夠在5 min 內(nèi)完成新冠病毒陽性樣本的測試；以色列希伯來大學(xué)研究人員使用磁性納米粒子材料提取拭子中的RNA分子，檢測速度較原來提升了4 ～10 倍。表1 詳細(xì)列舉了我國已批準(zhǔn)的新冠病毒檢測試劑盒。

表1 我國已獲批新冠病毒檢測試劑清單

病原體的檢測一般可分為病毒分離培養(yǎng)檢測、針對病毒RNA的分子生物學(xué)檢測和基于病毒抗原-抗體反應(yīng)的免疫學(xué)檢測，下面將詳細(xì)介紹各種檢測方法。

2.1 分離培養(yǎng)檢測

分離培養(yǎng)法自1913 年首次用于牛痘病毒的培養(yǎng)，經(jīng)過百年的發(fā)展，檢測準(zhǔn)確性較高，是病毒鑒定檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”［13］，但由于該方法對技術(shù)的要求高，測樣所耗時間長，操作步驟繁瑣，故無法適應(yīng)于病原體的快速檢測。分離培養(yǎng)SARS-CoV-2 并用電鏡技術(shù)進(jìn)行觀察研究，為病毒致病機(jī)理、疫苗和藥物的研究做出重要貢獻(xiàn)，目前已有數(shù)篇SARS-CoV-2 病毒分離鑒定的文章，如Lu等［14］通過人氣道上皮細(xì)胞（HAE）對病毒進(jìn)行分離培養(yǎng)，并使用電鏡來觀察病毒的形態(tài)變化，3 次傳代后收集標(biāo)本上清液進(jìn)行檢測來確定是否為新型冠狀病毒。當(dāng)然，不同的細(xì)胞受SARS-CoV-2 病毒的感染程度不同，發(fā)表在Cell 上的文章表明［15］，只有低于10%的呼吸道細(xì)胞和腸道細(xì)胞會同時產(chǎn)生ACE2 及有助于激活新冠病毒S蛋白的TMPRSS2 酶，這些細(xì)胞可分為鼻腔黏液中的杯狀細(xì)胞、肺部的Ⅱ型肺泡細(xì)胞及小腸內(nèi)的吸收性腸上皮細(xì)胞。與此同時也有研究表明，ACE2 和TMPRSS2 酶可以在包括鼻氣道中的細(xì)胞中表達(dá)，尤其是鼻腔黏液中的杯狀細(xì)胞和纖毛細(xì)胞中，這兩種蛋白含量最高，研究人員推測這有可能是SARS-CoV-2 的最初感染途徑［16］。因此，樣本來源可優(yōu)先選擇這些部位的細(xì)胞進(jìn)行新冠病毒的分離培養(yǎng)，一般分離培養(yǎng)過程是收集人氣道上皮細(xì)胞培養(yǎng)4 ～6周后，于其頂面接種加入病毒載體的支氣管肺泡灌洗液樣品上清液，3 次傳代后可收集樣本觀察檢測。對新冠病毒傳染范圍廣這一特點，醫(yī)療團(tuán)隊需要可以迅速檢測病原體的方法避免貽誤最佳治療時機(jī)，該方法無法滿足這一條件，不適用于新冠病毒的快速檢測。

2.2 分子生物學(xué)檢測

這是一種病原體檢測從蛋白質(zhì)及細(xì)胞層面進(jìn)入到核酸序列檢測上的方法，目前發(fā)展比較熱門的領(lǐng)域當(dāng)屬核酸擴(kuò)增技術(shù)、測序技術(shù)及基因芯片。SARS-CoV-2是單鏈的RNA 病毒，因此需逆轉(zhuǎn)錄先合成互補的cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行檢測［5］。

2.2.1核酸擴(kuò)增技術(shù)

核酸擴(kuò)增技術(shù)又分為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)和恒溫擴(kuò)增技術(shù)。PCR 在20 世紀(jì)80 年代就已經(jīng)開發(fā)應(yīng)用于核酸擴(kuò)增［17］，其具有靈敏度高、操作簡便、結(jié)果精準(zhǔn)等優(yōu)點，因此在此基礎(chǔ)上又衍生出實時熒光PCR、多重PCR 等技術(shù)，是病原體檢測中最為常見的檢測手段。恒溫擴(kuò)增技術(shù)只需要一些簡單的水浴、空氣浴等恒溫儀器就可以完成基因序列的擴(kuò)增過程，可以不用依賴昂貴笨重的熱循環(huán)儀器。恒溫擴(kuò)增技術(shù)通常包括轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增技術(shù)（transcription mediated amplification，TMA）、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等?；诓《竞怂岬姆肿由飳W(xué)檢測，也已研制出多種檢測試劑盒用于新冠病毒的檢測，截至2020年4 月22 日國家獲批的19 個核酸檢測試劑盒中，熒光PCR 法就占到了12 個，是一種非常普遍的檢測方法。下面簡要介紹核酸檢測試劑盒的3 種研制技術(shù)。

（1）熒光PCR法。熒光PCR是在常規(guī)PCR檢測的基礎(chǔ)上加入了熒光物質(zhì)，通過監(jiān)測發(fā)光信號來進(jìn)行分析的一種方法。TaqMan 是最為常用的一種探針染料，基本原理是設(shè)計合成能與目標(biāo)基因特異性結(jié)合的探針，分別于其5′端和3′端標(biāo)記熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)，PCR擴(kuò)增時由于Taq 酶將探針5′端的熒光基團(tuán)切割導(dǎo)致其與探針分離，從而發(fā)出熒光。用于新冠病毒檢測的熒光檢測試劑盒，以新冠病毒ORF1ab 基因和N基因中的序列為靶位點進(jìn)行特異性引物的設(shè)計，并以寡核苷酸作為熒光探針對病毒的核酸進(jìn)行檢測。若要確認(rèn)一個病例為陽性，則需滿足在同一份檢測標(biāo)本中新冠病毒的ORF1ab 及N 基因的熒光PCR 檢測結(jié)果均為陽性，若檢測條件受限，至少應(yīng)對新冠病毒的ORF1ab基因進(jìn)行檢測［18］。熒光PCR 檢測技術(shù)是一種最為常見的核酸檢測方式，已廣泛應(yīng)用于生物及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，在此次新冠病毒的檢測中也發(fā)揮了巨大的作用。

（2）微流控芯片法。微流控芯片是集樣品的制備、反應(yīng)、擴(kuò)增、檢測等基本操作單元于一塊微米級芯片上，是操作、檢測一體化的整合技術(shù)，可實現(xiàn)多個樣品在幾分鐘內(nèi)平行檢測［19］，通過液體聯(lián)通各個單元，具有液體流動可控、樣品消耗少、檢測速度快、成本低等優(yōu)點，可用于病原體核酸的檢測。和受限于傳熱速度的常規(guī)PCR 技術(shù)相比，微流控PCR 芯片由于本身的體積及熱容較小，因而傳熱速度快，有效的縮短了病原體的檢測時間［20］。微流控芯片技術(shù)在病原體的檢測過程中標(biāo)本的取樣量少，通常需要5 ～50 μL就可以完成檢測，且檢測靈敏度高及制作成本低廉，是新冠病毒檢測中的一種不可或缺的方法。

（3）恒溫擴(kuò)增法。以環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）為例，在恒溫65 ℃的條件下，1 h內(nèi)就可以將目標(biāo)DNA 從幾個拷貝擴(kuò)增到109拷貝［21］。LAMP 測序過程中不需要昂貴笨拙的熱循環(huán)儀器，只需要在恒溫65 ℃就可以完成，且擴(kuò)增產(chǎn)物通過顏色變化或是否產(chǎn)生沉淀等現(xiàn)象可以用肉眼觀察，如Besuschio 等［22］利用鈣黃綠素可以與LAMP 反應(yīng)體系中的Mg2+結(jié)合使得顏色由黃變綠這一特點來判斷檢測結(jié)果。此方法檢測速度快，尤其是靈敏度比較高，因此在核酸檢測試劑盒中應(yīng)用比較廣泛。

核酸檢測中的熒光PCR技術(shù)特異性較強，擴(kuò)增和檢測同時完成，但受傳熱速度及裝置熱容的限制，整個擴(kuò)增過程需要幾個小時，耗時較長，只能相對定量，可以用于新冠病毒確診檢測；微流控芯片技術(shù)靈敏度高，如Cooper等［23］實現(xiàn)了血液中低至1 拷貝/mL 的快速分離檢測，特異性較好，且檢測速度快，有報道稱其能夠在17 min內(nèi)完成34 個PCR的循環(huán)［24］，可以實現(xiàn)絕對定量，適應(yīng)于病毒確診檢測，但檢測通量較低，如多個芯片的同時檢測會受到一定的限制，因此在常規(guī)的檢測中沒有優(yōu)勢；LAMP 技術(shù)是在PCR 技術(shù)之后逐漸發(fā)展起來的一種恒溫高效、特異性強的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，靈敏度也比較高，在使用RT-LAMP 技術(shù)進(jìn)行口蹄疫病毒檢測［25］的案例中的檢測靈敏度達(dá)到103拷貝/μL，但檢測成本相對較高，可以用于病毒的初篩檢測。

2.2.2 測序技術(shù)

先頭的特務(wù)連早已剪斷了鬼子的電話線。當(dāng)他們排著整齊的隊伍走出包圍圈時，一出機(jī)場就遭到日軍哨兵盤問，十六師副師長顧宏用日語說：我們是皇協(xié)軍，奉命由胡村調(diào)防上葉。

測序技術(shù)首先在20 世紀(jì)70 年代由英國科學(xué)家Sanger等［26］建立，開創(chuàng)了鏈終止法，基于化學(xué)降解法的第一代測序由此形成，但測序成本較高，為滿足測序要求而發(fā)展起來的下一代測序技術(shù)（next generation sequencing，NGS），包括邊合成邊測序的第2 代測序技術(shù)［27］，單分子實時測序的第3 代［28］及納米孔單分子測序的第4 代測序技術(shù)［29］。美國疾病預(yù)防控制中心（CDC）在GenBank 上公布了Sanger 測序及納米孔測序的新冠病毒序列［30］，Lu 等［14］也通過納米孔測序在內(nèi)的測序技術(shù)對新冠病毒感染者的全長基因組進(jìn)行了分析。

從第1 代測序技術(shù)優(yōu)化到第4 代的固態(tài)納米測序技術(shù)，準(zhǔn)確度提高，測量成本降低，測序時間變短，方便人們準(zhǔn)確獲取基因組信息并用于疾病的治療。

2.2.3 基因芯片

基因芯片又稱DNA微陣列、DNA芯片，取樣后利用核酸分子雜交技術(shù)，通過熒光標(biāo)記序列與事先設(shè)計好固定在基底上的探針在一定條件下雜交，并對信號進(jìn)行檢測樣品中mRNA或DNA 的相對濃度［31］。該技術(shù)從樣品的制備到完成反應(yīng)后結(jié)果的檢測都集中在芯片中，經(jīng)過一次分析可得到多個基因序列，相較于傳統(tǒng)檢測具有自動化程度高、效率高、成本低等優(yōu)點［32］。

2.3 免疫學(xué)檢測

在新冠病毒爆發(fā)的前期，唯一的核酸診斷檢測手段是逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)，在病人早期診斷中發(fā)揮了巨大作用，是最有效的檢測途徑。但病人到了后期產(chǎn)生一定抗體后，就可以采用免疫學(xué)檢測方法。基于酶聯(lián)免疫檢測法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和膠體金檢測法的IgM 和IgG 抗體檢測試劑盒也已經(jīng)上市，這是與針對病毒RNA的分子生物學(xué)檢測高度互補的另一種檢測技術(shù)。該技術(shù)基于血清中抗原和抗體的特異性結(jié)合進(jìn)行檢測，通過已知的抗原（抗體）來檢測病原體的抗體（抗原），因此可以用來方便、迅速鑒定病原體［33-34］。相較于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法及繁雜的分子生物學(xué)檢測，此方法明顯在操作步驟上得到了簡化。尤其是隨著大量無癥狀感染者（核酸檢測呈陽性，包含感染過新冠病毒但自身已經(jīng)產(chǎn)生保護(hù)性抗體的痊愈者和未發(fā)病的感染者）的出現(xiàn)，核酸檢測外加做抗體檢測十分必要，有利于人群分層管理：因為IgG存在于人體血清中時間長，而IgM 當(dāng)疾病感染人體結(jié)束后通常消失。如果IgM 呈陰性而IgG 呈陽性，意味著受檢者曾感染過病毒但已產(chǎn)生抗體，不再需要隔離。如果IgG 和IgM 都呈陽性，那么受檢者可能是已感染病毒尚未發(fā)病，需要進(jìn)行醫(yī)學(xué)觀察與隔離（處于潛伏期的最終會發(fā)病，具有傳染性；有些隱性感染者則不會發(fā)病，直到最后自愈，不具有傳染性）。

（1）酶聯(lián)免疫檢測法。酶聯(lián)免疫檢測法（ELISA）是抗原抗體反應(yīng)與酶科學(xué)相互結(jié)合的一種常見的免疫分析方法，即固相載體表面的抗原或抗體仍具有免疫學(xué)活性，而經(jīng)酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留著酶的活性，同時也具有免疫學(xué)活性［35］。在檢測時標(biāo)本中的抗體（抗原）與固相載體表面的抗原（抗體）發(fā)生特異性反應(yīng)形成抗原抗體復(fù)合物，加入酶標(biāo)記的抗原或抗體后也在固相載體表面發(fā)生復(fù)合，由于固相載體中受標(biāo)檢測物與酶的量成一定的比列關(guān)系，通過酶催化底物顏色的深淺變化進(jìn)行定性或定量的分析從而達(dá)到檢測的目的。眾所周知，酶的催化效率比較高，因此該方法在靈敏度方面具有很大的優(yōu)勢，是一種比較常見的新冠病毒檢測手段。

（3）膠體金法。膠體金檢測試紙條的結(jié)構(gòu)一般為：以塑料板作為底板，在其中間粘貼硝酸纖維素膜（NC膜），并在NC膜兩端粘貼試劑墊以及吸水膜，試劑墊與NC膜間的連接處粘貼膠紙用于控流。金標(biāo)物與樣本中的待測物發(fā)生特異性結(jié)合而成的聚合物，在NC膜上擴(kuò)散，到達(dá)C、T 線結(jié)合包被物后會顯示出裸眼觀測的條帶［37］。此種方法的試劑盒易于商品化和標(biāo)準(zhǔn)化，操作簡便，反應(yīng)快速，適應(yīng)于大規(guī)模人群的篩查，在此次新冠病毒的檢測中應(yīng)用較為廣泛。

免疫學(xué)檢測通過對人體血清中病原體所產(chǎn)生的特異性抗體的檢測，在傳統(tǒng)的臨床病原體檢測中非常常見，以上列舉的三類具體實施方案也各有優(yōu)缺點：酶聯(lián)免疫檢測法對設(shè)備要求低、檢測靈敏度高、操作方法簡便、特異性較強且檢測成本低，但由于操作步驟多，因此耗時較長，通常只能定性或半定量檢測，該技術(shù)比較適合基層的檢測機(jī)構(gòu)用于大規(guī)模的篩查；化學(xué)發(fā)光法是一種比較先進(jìn)的免疫檢測技術(shù)，能夠達(dá)到定量檢測的目的，具有自動化程度高、操作簡便、特異性強、方法穩(wěn)定及靈敏度高等優(yōu)點，但儀器及試劑成本較高，無法大規(guī)模篩查；膠體金法操作簡便、反應(yīng)迅速，但靈敏度相對不高且無法定量檢測，可以用于輔助快速篩查。

2.4 其他新型檢測技術(shù)

如圖3 所示，Munster團(tuán)隊報道了一種通過檢測不同細(xì)胞被病毒所感染的差異性來迅速篩查冠狀類病毒的方法［11］。具體來說，新冠病毒S 蛋白的RBD（受體結(jié)合域）是與人體細(xì)胞中的受體直接作用的中介，通過檢測與病毒結(jié)合的ACE2（血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2）、與MERS病毒結(jié)合的DPP4（二肽基肽酶）等受體與RBD的作用情況，即RBD 有3 個分支，結(jié)合ACE2 后就屬于分支1，通過這種方法，就能快速的確認(rèn)新冠病毒的檢測結(jié)果。而這種新方法只需要檢測S 蛋白RBD 的序列，取代了傳統(tǒng)方法中對于S蛋白全長序列的合成，因此大大提高了檢測速度。

圖3 病毒S 蛋白通過RBD 與ACE2 受體結(jié)合進(jìn)入人體細(xì)胞［11］（經(jīng)許可復(fù)制，Copyright? 2020 Springer Nature）

基于CRISPR/Cas 系統(tǒng)檢測RNA 的基因編輯技術(shù)，在很多領(lǐng)域得到了迅速發(fā)展，此技術(shù)可以進(jìn)行生物體內(nèi)的基因編輯修飾［38］。CRISPR系統(tǒng)可以特異性的檢測RNA從而鑒定所檢測的樣本中是否有特定序列的存在，進(jìn)而達(dá)到病原體檢測的目的。其中，張鋒團(tuán)隊由此開發(fā)的SHERLOCK （specific highsensitivity enzymatic reporter unlocking）技術(shù)比較經(jīng)典［39］。即gRNA會識別新冠病毒的S基因和ORF1ab基因，并引導(dǎo)Cas13 對這兩個基因進(jìn)行切割，通過確認(rèn)是否被切斷從而得到新冠病毒檢測的結(jié)果［40］，詳細(xì)過程見圖4。檢測時首先在42 ℃下通過恒溫擴(kuò)增技術(shù)對核酸樣本進(jìn)行擴(kuò)增，其次在樣本中加入Cas13、gRNA 等分子在37 ℃下反應(yīng)30 min，最后使用試紙進(jìn)行檢測。需要說明的是單獨使用CRISPR檢測技術(shù)通常無法達(dá)到臨床檢驗的靈敏度，因此需要和擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合來進(jìn)行新冠病毒的檢測，目前張鋒等人已經(jīng)公開了結(jié)合擴(kuò)增技術(shù)的新冠病毒CRISPR 檢測法，國內(nèi)也有如吐露港等公司開發(fā)的基于CRISPR 的檢測技術(shù)，但都需要臨床樣本的實際檢驗。

圖4 以編程方式切割與其CRISPR RNA（crRNA）互補的RNA［41］（經(jīng)許可復(fù)制，Copyright? 2019 Elsevier）

3 小結(jié)與展望

新冠病毒的感染是全球面臨的一次嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，快速診斷，及時治療是打贏這場攻堅戰(zhàn)的關(guān)鍵。面對傳染性強且感染人數(shù)眾多這一現(xiàn)狀，準(zhǔn)確測量快速的檢測試劑盒的研制至關(guān)重要，目前世界各地均已研制出多種核酸和抗體檢測試劑盒。

核酸檢測是病原體診斷的一種依據(jù)，也是目前確診最重要的手段，作為檢測最重要的標(biāo)準(zhǔn)，扮演著難以取代的作用。在病毒核酸檢測中，有的疑似新冠肺炎患者前幾次檢測呈陰性，但在多次檢測后最終呈陽性。核酸檢測中的“假陰性”頻發(fā)受到了廣泛關(guān)注，原因除了患者自身的病程發(fā)展之外，還有一個重要的原因在于目前核酸檢測手段過程中有很多的不確定性，應(yīng)當(dāng)科學(xué)看待，不排除部分試劑盒質(zhì)量不高的情況。例如：美國在疫情初期就曾回收過發(fā)放的不合格試劑盒。同時也應(yīng)該考慮到新冠病毒感染的特點，導(dǎo)致樣本在采集中出現(xiàn)問題。首先，病人采樣的時間段也影響采集的病毒數(shù)量，比如早期，中期和晚期，早期例如潛伏期時沒有癥狀，病毒數(shù)量可能較少，中期采集到的病毒數(shù)量就相應(yīng)多。例如SARS病人3 周后的血液病毒數(shù)量反而減少了。其次，采樣方式也會影響檢測結(jié)果。已經(jīng)知道在常用的采樣中，咽拭子，唾液，痰液，肺泡灌洗液中以肺泡灌洗液采集陽性率最高。目前常用的檢測手段是咽拭子采集疑似病患樣品，采樣的部位是上呼吸道咽，不是病毒容易侵犯的下呼吸道。同樣，病毒在血液、尿液、糞便中也能檢出，但因為并不是主要感染部位，病毒含量較少，不能作為檢測依據(jù)。同時，由于RNA 很不穩(wěn)定，容易降解，采集后樣品的處理和提取是否合理也是影響因素。核酸檢測除了樣品采集方面的問題外，還在檢測時長、防護(hù)要求等方面，想要滿足大范圍的檢測比較困難。就檢測時間而言，不算樣本的處理時間，PCR 的升溫降溫過程就需要2 h；此外，防護(hù)要求相對較高，需要2 級防護(hù)且專門配備PCR儀的實驗室及3 級防護(hù)且經(jīng)過嚴(yán)格培訓(xùn)的人員要求。而抗體作為人體應(yīng)激反應(yīng)的產(chǎn)物均勻分布在血液中，與核酸檢測相比更容易獲取樣本且檢測時間較短，極大的降低了醫(yī)護(hù)人員在取樣及檢測過程中被感染的風(fēng)險，目前針對“假陰性”的一個行之有效的辦法就是在核酸檢測的基礎(chǔ)上補充新型冠狀病毒特異抗體檢測［42］。因此，在實驗過程中，任何一個環(huán)節(jié)都不容忽視，否則會產(chǎn)生“假陰性”等問題。隨著疫情大范圍爆發(fā)且出現(xiàn)無癥狀感染患者，新的檢測手段也層出不窮。如基于等離子體光熱生物傳感器（plasmonic photothermal biosensor）的檢測方法［43］，基于電解質(zhì)場效應(yīng)晶體管（FET）的生物傳感檢測［44］和北京大學(xué)伊成器課題組提出的基于轉(zhuǎn)座酶的TRACE（Transposase assisted RNA/DNA hybrid Co-tagmEntation）建庫測序技術(shù)等。

為保障檢測結(jié)果的質(zhì)量，除了采用合格的試劑盒與合理的采樣手段，還需要做到樣本的采集與輸送必須嚴(yán)格遵循程序；對可疑樣本，可以選用不同的檢測方法反復(fù)確認(rèn)；檢測后定期抽取檢測樣本交由第三方實驗室評估以保障檢測的準(zhǔn)確性等。各類方法揚長避短，發(fā)揮出最大的優(yōu)勢，使新冠病毒的檢測更迅速、檢測結(jié)果更可靠。