鄰氨基苯酚對水生生物毒性效應

林紹霞，龔會琴，李 俊，楊鴻波

（貴州省分析測試研究院，貴陽550014）

0 引 言

鄰氨基苯酚分子中含有一個羥基和一個氨基，屬兩性有機化合物，表觀顯示Lewis 酸、堿兩性，是一種重要的工業原料［1］，廣泛用于毛皮染料及有機合成和染料中間體，如生產酸性媒介藍R、硫化黃棕、熒光增白劑EBF等［2］。不僅是農藥伏殺硫磷的主要原料，還可作為脂肪酸化學修飾劑用于分析脂肪酸，由鄰氨基苯酚與羰基化合物合成的Schiff堿及某些金屬配合物在催化行為、磁學性質和酶模擬等方面也有重要作用。鄰氨基苯酚在污水處理系統中作為解偶聯劑能優化活性污泥產率［3］，進入水體造成水環境污染，且具有毒性大難以生物降解的特性［4］。已有研究證明，長期使用含氨基苯酚的染發劑會對人體健康造成危害［5］，因此，歐盟、日本等對化妝品中氨基苯酚最大限量作了明確規定，我國《化妝品衛生規范》也對其制定了嚴格限量標準［6］。而目前針對鄰氨基苯酚的報道多集中在污水凈化處理［3］、化學工藝設計［7］方面，對鄰氨基苯酚環境毒性效應的研究未見相關報道，進入水環境后對水生生物的抑制效應及濃度水平鮮有研究。

毒性試驗通過設計一系列隨化學物質濃度不斷增高而設置的容器中進行化學物質致死或亞致死效應的典型分析，生物體對濃度不斷增高的化學物質的反應是重要的測定終點［8］。水生生態系統中，從食物鏈關系考慮，大型溞以浮油植物為食，同時又是魚類和大型無脊椎動物的餌料，是水生態系統中物質循環和能量流動的重要環節［9］。本研究以水生生態系統營養級上的3 種代表性生物：單細胞類的羊角月牙藻（Selenastrum capricornutum）、大型溞（Daphnia magna）和稀有鮈鯽（Gobiocypris rarus）為試驗生物，通過研究鄰氨基苯酚對3 種生物食物鏈水平的毒性數據，預測其環境無影響濃度（PNECs），通過濃度-效應曲線測定生物在特定環境濃度下的生物學反應［10］。旨在為制定鄰氨基苯酚的水生生物基準值提供參考數據，為水環境標準制定和水環境管理提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 受試生物

試驗所用的羊角月芽藻、大型溞和稀有鮈鯽種源均購于中科院水生生物研究所，其中羊角月牙藻和大型溞在試驗條件下培養直至滿足試驗要求。試驗生物信息見表1 所示。

表1 試驗生物特征

1.1.2 試驗物質

鄰氨基苯酚：淺灰色粉末，純度99%，購于阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.1.3 試驗用水

試驗用水為貴陽市市政居民飲用自來水，經曝氣脫氯72 h以上，控制水質指標范圍：pH6 ～9，水硬度以CaCO3計＜180 mg/L，水中溶解氧（DO）含量為80%～110%，大于空氣中飽和氧含量的80%。

1.1.4 試驗儀器

電子天平（Al204，梅特勒），pH 計（PHB-4，上海雷磁），藻類計數儀（S200、杭州迅速）、照度計（T-10A，柯尼卡美能達），高效液相色譜儀（1260，安捷倫），人工氣候培養箱（RGX-250，泰斯特），溶解氧測定儀（HQ30d，哈希）。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗環境條件

羊角月芽藻：按照文獻［11］中制備的無機鹽培養液中進行，并控制試驗溫度（23 ±2）℃；光/暗比14 h/10 h；光照強度4 400 ～8 800Lux［12］。

大型溞：曝氣自來水中進行，并控制溫度20 ℃，持續黑暗。

稀有鮈鯽：曝氣自來水中進行，溫度（24 ±0. 2）℃；光照12 ～16 h/d；試驗水pH ＝8.0 左右；溶解氧不低于空氣飽和值的60%。

1.2.2 試驗方法

分別用無機鹽營養液、曝氣自來水制備鄰氨基苯酚試驗溶液，并以一定比例間距配制系列梯度試驗溶液，在不同濃度溶液中引入受試生物，進行毒性暴露試驗，并設置空白對照組。

羊角月芽藻試驗用無機培養分別配制濃度0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/L 鄰氨基苯酚溶液100 mL，引入藻種使藻細胞濃度達1 ×104cells/mL，于試驗開始后24、48、72 h通過觀察溶液中細胞數，評價羊角月芽藻在受試物溶液中的生長抑制情況，試驗過程中監測試驗溶液pH值及溶液中鄰氨基苯酚濃度變化情況。

大型溞試驗用曝氣自來水制備鄰氨基苯酚溶液系列濃度為1. 4、1. 7、2. 0、2. 4、2. 9、3. 5 mg/L 各100 mL，每個溶液中轉入處于對數生長期的幼溞5 只，于試驗開始后24、48 h觀察并記錄試驗溞活動狀況以評價大型溞受抑制效應，試驗過程中監測溶液pH值、溶解氧和鄰氨基苯酚濃度。

稀有鮈鯽試驗用曝氣自來水制備濃度為0. 80、0.96、1.15、1.38、1.66、2.00、2.40 和2.88 mg/L 溶液各3 L，每個溶液中引入10 尾魚，分別于3、6、24、48、72 和96 h觀察受試魚的中毒癥狀并及時取出死魚，每24 h統計一次受試魚的死亡率，監測溶液pH值、溶解氧、鄰氨基苯酚濃度。

1.2.3 計 算

（1）羊角月牙藻抑制濃度。羊角月牙藻生物量增長的抑制百分率

式中：Iy為試驗組生物量增長的抑制百分率，%；Yc為空白對照組測定的藻單位生物量；Yt為試驗組測定的在單位生物量。

藻生長率的抑制百分率

式中：Ic為試驗組藻生長率的抑制百分率，%；μc為空白對照組生長率；μt為試驗組生長率。

式中：μj-i為在時間點i到時間點j之間的平均生長率；Xi為在時間點i時的藻單位生物量；Xj為在時間點j時的藻單位生物量。

（2）半數效應濃度計算。試驗數據用SPSS15.0進行處理，計算鄰氨基苯酚對羊角月牙藻、大型溞、稀有鮈鯽半數毒性效應的濃度EC50/LC50和95%置信限。

2 結果與分析

2.1 鄰氨基苯酚對羊角月牙藻的毒性效應

在僅有無機培養基存在的空白對照處理中，羊角月牙藻細胞呈對數迅速增長，而含鄰氨基苯酚的溶液均對藻細胞生長具有不同的抑制作用。從表2 可見，培養72 h后，空白對照中藻細胞增長為初始時的253倍，隨著溶液中鄰氨基苯酚濃度的增大，藻細胞增長率銳減，當鄰氨基苯酚溶液濃度達1.6 mg/L時，培養72 h后，溶液中藻細胞僅增長為初始的6 倍，表明鄰氨基苯酚的存在嚴重抑制了藻細胞對數增長的規律。試驗結果顯示，當鄰氨基苯酚濃度達0.8 mg/L時，72 h 對藻生長抑制率已達56.66%，經計算得鄰氨基苯酚對羊角月芽藻的生長抑制率達50%時的濃度即72 h 的EC50為0.78 mg/L。

表2 不同暴露條件下羊角月芽藻生物量結果

在鄰氨基苯酚作用下，羊角月牙藻細胞形態也發生變化，如表3 所示。當鄰氨基苯酚濃度≥0.8 mg/L時，在暴露24 h后，可觀察到藻細胞明顯變小的現象，影響細胞分裂過程。

表3 不同暴露條件下藻細胞形態

2.2 鄰氨基苯酚對大型溞的毒性效應

為避免試驗溶液中溶解氧、pH值變化對溞的正常活動產生影響，實時監測溶液pH值，保證試驗時溶液pH值始終維持在7.5 ±0.2，溶解氧濃度為9.5 mg/L以上，溫度維持在（20 ±0.2）℃，以避免溞出現非毒性作用的異常死亡。

鄰氨基苯酚對大型溞毒性作用如表4 所示，在暴露24 h條件下，鄰氨基苯酚溶液濃度為2.0 mg/L時，溞開始表現出游泳緩慢和死亡的現象，當濃度達2.9 mg/L時，對溞的毒性效應達到半數致死；在暴露48 h條件下，鄰氨基苯酚溶液濃度1.4 mg/L 時，溞即開始表現出游泳緩慢和死亡的現象。經計算得鄰氨基苯酚對溞半數效應濃度24 h的EC50為2.6 mg/L，95%置信限為2. 4 ～ 2. 9 mg/L；48 h 的EC50為2. 2 mg/L，其95%置信限為2.0 ～2.4 mg/L。

表4 不同暴露條件下大型溞毒性效應

2.3 鄰氨基苯酚對稀有鮈鯽的毒性效應

為避免水環境因素對稀有鮈鯽正常活動的影響，試驗中各試驗溶液的溶氧量控制在空氣飽和溶解氧的70% ～100%之間，pH 值為8.0 ±0.2，溶液溫度為（24±0.2）℃ 范圍內，以準確表達鄰氨基苯酚對魚的毒性效應。表5 所觀察的試驗現象顯示，在暴露96 h后，當鄰氨基苯酚溶液濃度為0.96 mg/L時，稀有鮈鯽出現中毒現象。鄰氨基苯酚濃度為2.88 mg/L 時，稀有鮈鯽暴露48 h后即表現出側翻、頻繁換氣等中毒癥狀，暴露72 h即全部致死。

在鄰氨基苯酚濃度為0.96 mg/L 時，稀有鮈鯽暴露96 h后死亡率達20%，濃度為2.40 mg/L 時，暴露72 h即全部致死，通過建立魚死亡率與鄰氨基苯酚濃度相關性，計算鄰氨基苯酚對稀有鮈鯽48 h的LC50為2.52 mg/L，95% 置信限為2.13 ～ 2.97 mg/L；72 h 的LC50為1.52 mg/L，95% 置信限為1.22 ～1.89 mg/L；96h的LC50為1.16 mg/L，95%置信限為0.92 ～1.47 mg/L如圖6 所示。在96 h 的試驗周期內，使稀有鮈鯽全部死亡的鄰氨基苯酚最低濃度，及最低可觀察效應濃度（LOEC）為2.00 mg/L，全部存活的最高濃度，即無觀察效應濃度（NOEC）為0.80 mg/L。

表5 不同暴露條件下魚毒性效應

表6 不同暴露條件下稀有鮈鯽死亡率

3 討 論

3.1 鄰氨基苯酚的生物毒性效應級別

根據國家環境保護總局對化學品管理毒性分級標準［13］，鄰氨基苯酚對羊角月牙藻72 h 的EC50為0.78 mg/L ＜1 mg/L，屬極高毒性級別，對大型溞48 h 的EC50為2.2 mg/L，介于1 ～10 mg/L 間，屬高毒級別；稀有鮈鯽96 h 的LC50為1.16 mg/L，介于1 ～10 mg/L間，亦屬高度級別。從化學品風險控制的角度出發，危險化學品毒性劃分應以敏感性生物限制為原則進行管控［14］，因此判定鄰氨基苯酚對水生生物毒性時，應以敏感性水生生物——羊角月牙藻的毒性效應為限制標準，將鄰氨基苯酚視為對水生生物具有極高毒性的一類物質進行管理。

3.2 鄰氨基苯酚水生生物危害性

鄰氨基苯酚水生生物毒性的研究未見報道，而對其同分異構體——對氨基苯酚的毒性研究顯示，含對氨基苯酚的廢水具有高的生物急性毒性，對梨形四膜蟲、斑馬魚的24 h急性毒性LC50分別為19.5 和32.5mg/L［15］，說明處于食物鏈底端的低等級水生生物對氨基苯酚毒性更為敏感，而本研究得出單細胞藻的敏感性更高的結論，進一步驗證了氨基苯酚的毒性效應規律。魚類作為這一食物鏈上高級消費者，鄰氨基苯酚通過魚類以直接攝入或食物鏈累計的方式影響魚的生長、發育和生存。在水生生物危害性試驗中，為避免試驗介質的差異導致試驗生物的異常反應，需嚴格控制各種非生物因子的影響，如水溶液中溶解氧濃度、溫度、氫離子濃度（pH值）等，以控制試驗影響因素的一致性。隨著鄰氨基苯酚在毛皮染料、農藥生產原料、污水處理中解偶聯劑的應用，對水環境的危害風險逐步加大。鄰氨基苯酚對水中微生物有抑制作用，受污染水的可生化性不強，致使水不能直接進行生化處理加以凈化，針對水中鄰氨基苯酚去除方法的研究在不斷探索中［16］。

3.3 鄰氨基苯酚環境風險性

雖然化學品對水生生物的環境風險取決于毒性效應和環境暴露量兩方面，在暴露量無法評估的情況下，環境風險的監管還是依靠代表性生物的急性毒性試驗數據為化學品風險管理提供重要參考依據。本研究結果顯示，鄰氨基苯酚對淡水生態系統食物鏈上3 個營養級別上的代表性生物均具有高的毒性，其中對單細胞羊角月牙藻的最為敏感，72 h的EC50為0.78 mg/L，已達到極高毒性級別，對稀有鮈鯽和大型溞的毒性效應都為高毒級別，因此對其風險監管應立足與極高毒性級別的管控，屬環境危害高風險物質。

4 結 語

鄰氨基苯酚作為重要的化工原料而廣泛用于生產制備，其向環境擴散將構成嚴重環境生態。本研究得出，鄰氨基苯酚對淡水生態系統食物鏈的3 個營養級別上代表性生物均具有高的毒性，其中對單細胞羊角月牙藻的最為敏感，72 h的EC50為0.78 mg/L，已達到極高毒性級別。對稀有鮈鯽和大型溞的毒性效應都為高毒級別。

鄰氨基苯酚是一種致敏性物質，與人體接觸會引起氣管類疾病和接觸性的皮膚炎，鄰氨基苯酚吸入過量時，會引起對人的生命造成威脅的高鐵血紅蛋白血癥。若鄰氨基苯酚泄漏到自然環境中，對環境造成的危害將不可逆轉性。因此，必須完善對鄰氨基苯酚污染水體的控制措施，提高對鄰氨基苯酚管控力度，盡最大可能降低鄰氨基苯酚對水環境的危害程度。