結構光照明顯微鏡的實驗教學設計

繳 莉，劉如明，龍加福，周 穎

（南開大學生命科學學院，天津300071）

0 引 言

顯微鏡教學是現代生物學教學課程中的重要組成部分，是培養學生實踐能力、科研思維的重要教學環節。隨著科學技術的發展，越來越多的大型儀器出現并應用于科學研究中，如激光掃描共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡、超高分辨顯微鏡等。這些大型儀器具有構造精密、操作復雜、運行維護成本高等特點，在實驗教學中通常只進行演示實驗，很少開放讓學生獨立操作［1-2］。對此，我校生命科學學院公共實驗平臺顯微成像儀器室在大型儀器實驗教學方式上進行了積極的思考與探索。本文將以大型精密儀器結構光照明顯微成像系統Delta Vision OMX SR為例，介紹OMX SR的工作原理和應用進展，詳細描述該顯微鏡的實驗教學課程設計內容。

1 結構光照明顯微鏡及其在生物學中的應用

1.1 結構光照明顯微鏡

結構光照明顯微鏡（SIM）是超高分辨顯微鏡的一種類型，結構光就是改變了空間結構的特殊調制光源。早在1999 年，Heintzmann 等［3］首次發表了用調制光照明樣品并獲得超分辨圖像的文章。在此基礎上，Gustafsson［4-5］實現了經典的二維結構光照明顯微成像技術2D-SIM。到2008 年，SIM 被成功應用到三維空間，實現了3D-SIM。至此，線性熒光激發的結構光照明技術將成像的空間分辨率提高了兩倍［6-7］。在2012年，Rego等［8］又用非線性結構光激發樣品并成像。與線性結構光照明顯微成像相比，非線性結構光照明顯微成像的分辨率進一步提高［9］。

光的衍射極限限制了光學顯微鏡成像分辨率的提高。根據光學傳遞函數，顯微系統只能接收樣品中低頻信息，代表細節的高頻信息將被濾除。結構光照明顯微鏡的成像原理是利用改變了空間結構的特殊調制光源照明樣品。根據莫爾條紋的原理，當調制光場的高空間頻率信息和樣品的高空間頻率信息相疊加時，這兩種高頻信息將被編碼成可以被探測、解析的低頻信息。已知調制光也就是其中一個高頻信息的參數包括入射角度、相位和光強分布，也已知疊加后的低頻信息。通過特定的計算機算法，樣品中代表細節的高頻信息就從探測到的低頻信息中解析出來，從而實現了顯微成像分辨率的提升［10］。

1.2 結構光照明顯微鏡在生命科學研究中的應用

結構光照明顯微鏡出現后被廣泛用于細胞內精細結構、蛋白精確定位和活細胞動態觀測等研究中。利用結構光照明成像技術，科學家們在亞細胞水平的研究有了新的發現和進展。

在研究細胞精細結構方面，2015 年，M?nkem?ller等［11］聯合使用3D-SIM 和dSTORMDE 清晰地解析了肝竇內皮細胞的結構。2017 年，Hong 等［12］用突觸前標記物突觸小泡蛋白和突觸后標記物PSD-95 標記了神經元，通過3D-SIM成像，成功解析了神經元突觸的精細結構。2017 年，Yadav 等［13］用3D-SIM 成功觀測到了血小板中的顆粒成分α-Granules。α-Granules 是血小板內部存在的顆粒成分，其平均直徑190 nm，長340 nm，彼此間距為20 ～50 nm。2018 年，Sawada等［14］用3D-SIM結合新的樣品處理方式，成功獲得了小鼠腦切片中樹突精細結構的圖像。

在研究蛋白定位方面，Roth等［15］研究了有絲分裂過程中凋亡抑制蛋白Survivin 的定位機制，利用3DSIM模式采集圖像后發現Survivin 的位置變化受到紡錘體的控制。Sternemalm［16］將SIM應用于小鼠肝臟肝竇內皮細胞中膜和細胞骨架聯系的研究中。肝竇內皮細胞負責調節血流和周圍組織中的物質交換，肝竇內皮細胞有很多大小不等的窗孔，窗孔直徑50 ～200 nm。橋粒是重要的細胞間連接結構，其直徑小于1 μm，細胞膜間間隙約為35 nm。在3D-SIM 模式下，Sternemalm發現CSPP-L 位于肝竇內皮細胞中橋粒致密斑的位置。2018 年，Pinnington 等［17］通過SIM 和單分子定位聯用研究了腫瘤細胞中樹突狀偽足的形成機制。SIM 也被用于植物領域的研究工作中，Lambing［18］用3D-SIM解析了擬南芥減數分裂過程中的聯會復合體結構動態變化，發現PCH2 出現在聯會復合物集結處。

與其他超分辨顯微鏡相比，SIM對樣品光損傷小、拍攝速度快，因此在活細胞觀測中有著優勢。Turnbull等［19］用SIM 研究了細菌Pseudomonas aeruginosa膜囊泡的形成機制和功能。細菌膜囊泡大小為50 ～250 nm，對3D-SIM觀察到的膜囊泡進行測量，發現SIM觀測到的膜囊泡直徑大小在150 ～300 nm。膜囊泡的產生是快速的動態變化過程，這對儀器的穩定性和速度要求很高。在3D-SIM 模式下進行時間序列掃描，發現膜囊泡在細胞裂解過程中產生。SIM時間序列掃描也被用于研究HeLa細胞中線粒體-溶酶體結合的動態變化過程［20］。在植物領域，SIM 時間序列掃描已被用于研究擬南芥多個組織和器官中微管的動態變化，包括微管的形成、分支、生長和衰退等過程［21］。

2 結構光照明顯微成像系統的實驗教學設計

結構光照明顯微成像系統DeltaVision OMX SR屬于大型儀器，其構造精密，操作步驟較復雜。合理的實驗教學設計是開展有效實驗教學的關鍵。

2.1 理論課程設計

首先，在理論課程上對SIM的成像原理和結構組成進行系統的介紹。在教學中，讓學生掌握扎實的理論知識是開展實驗課程和自主實驗設計的重要基礎，充分理解儀器的運行原理不僅能幫助學生更好地學習實驗技術，還能避免一些不規范的操作行為。接著，借助多媒體教學，圖文并茂地介紹SIM在動物、植物、微生物、材料科學等研究領域中的應用案例，讓學生明白SIM在科研中的重要作用和應用范圍。在教學PPT中加入大量的顯微拍攝圖像和時間序列掃描視頻，著重展示結構光照明顯微鏡圖像、激光掃描共聚焦顯微圖像、寬場圖像之間的區別。通過理論課程，讓學生掌握SIM的原理，了解其應用范圍，同時激發學生的學習興趣。

2.2 實驗課程設計

（1）小組教學。大型精密儀器對操作者的實驗技能要求較高，操作不當容易損壞儀器、造成損失。因此，在實驗技術訓練過程中，宜采取小組為單位的教學形式，根據專業或課題將學生分組，每組不超過10 人。小組教學的優點有，①能保證每個同學都有動手操作的機會；②教師能針對每個學生的操作進行指導，可以及時糾正錯誤操作；③利于教師維護儀器。

（2）開關機教學。DeltaVision OMX SR硬件組成主要包括電源、激光器、相機、顯微鏡、圖像采集工作站和圖像處理工作站。大型儀器的開關機順序復雜，激光器和相機等消耗性部件的使用和開關機要進行重點教學。錯誤的開關機順序會導致圖像采集失敗，嚴重的情況會對儀器造成損耗。因此，開關機教學中要求學生一定嚴格按照要求進行操作，重點記憶激光器、相機等部件的使用規范。

（3）鏡油的選擇。SIM 采用結構光照明，使用正確折光率的鏡油才能得到好的實驗結果。因此，鏡油的選擇至關重要。DeltaVision OMX SR配有一個63 ×油鏡（1.42 NA），與常使用的熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡不同，OMX SR 配有18 種不同折射率的鏡油。調整鏡油的實驗步驟是，首先在3DConventional拍攝模式下采集一張圖像。接著，根據Orthogonal的分析結果調整鏡油。當使用最佳折射率的鏡油時，會得到上下均勻的光分布圖（見圖1）。調整鏡油是SIM 拍攝的難點，也是教學的重點與難點。在教學過程中，盡量使用典型樣品，比如熒光小球等，讓學生記憶標準的光分布結果，在技能訓練過程中需要反復練習。

圖1 Orthogonal分析中光的對稱分布

（4）基本技能訓練。在教學中，實驗技能訓練采用先演示操作，再讓學生輪流上機操作的形式。以細胞樣品實驗教學為例，實驗中使用的細胞樣品用DAPI標記細胞核，Alexa Fluor 488 標記微管蛋白，DAPI 和Alexa Fluor 488 的激發光分別為405 nm和488 nm。

演示操作按以下步驟進行：① 選擇3DConventional模式，405 nm和488 nm兩個熒光通道，熒光灰度值控制在8 000 左右，樣品拍攝厚度為3 μm，每隔0.125 μm采集一張圖像。對得到的拍攝數據進行校色和三維最大投影，然后導出3D-Conventional 三維投影的結果。② 對3D-Conventional 的原始數據依次進行Deconvolution 算法處理、校色、三維最大投影，導出Deconvolution 三維投影的結果。③ 選擇3D-SIM拍攝模式，405 nm和488 nm兩個光通道，熒光灰度值同樣控制在8 000 左右，樣品拍攝厚度為3 μm，每隔0.125 μm采集一張圖像。對拍攝數據依次進行三維重構、圖像校色、三維投影，導出3D-SIM 的三維投影結果。④ 比較分析寬場圖像、Deconvolution 圖像和SIM圖像之間的差別，讓學生體會不同拍攝模式得到圖像分辨率的差別。比如，圖2 所示的結果顯示Conventional、Deconvolution 和SIM 均觀測到細胞核和微管的結構。通過比較發現SIM 圖像中細胞核和微管結構的細節最清楚，圖像分辨率和質量最高，其次是Deconvolution 的圖像。Conventional 的圖像有明顯光暈。

圖2 微管和細胞核的三維投影顯微圖像

在演示教學之后，讓學生輪流進行操作練習。大型儀器操作步驟多，學生需要反復練習才能熟練掌握。練習過程中老師全程陪同，對拍攝中的問題進行及時指導教學，直到學生能完成完整的實驗操作，采集到滿意的圖像。

（5）開放性實驗。為了充分調動學生學習的主動性和積極性，同時增加教學內容的豐富性和靈活性，教學設計中加入了開放性實驗內容。實驗教學面向研究生開展，在實驗課前1 周通知學生自主設計實驗、準備樣品。在掌握基本實驗技能的基礎上，讓學生根據自己的樣品選擇合適的拍攝模式，獨立設計拍攝方案，并獨立操作儀器。常見的拍攝樣品類型包括細胞樣品、組織切片和高分子材料等，OMX SR 配備的4 個激光光源能滿足學生使用的熒光染料或標記物的激發光要求。在實驗教學過程中，如果遇到問題，遵循先引導學生分析原因，再指導其制定解決方案的原則。最后將總結歸納的內容及時反饋給學生，幫助學生改進實驗方案。

（6）課程考核。考核與評價是實驗教學中的重要組成部分，是檢驗教學質量、教授與學習效果的有效手段。為了全面科學地評價學生的實踐能力和綜合素質，本教學方案將多元化設計實驗課程考核的內容。考核內容包括課堂出勤、實驗技能測試、自主實驗設計和實驗報告撰寫。實驗課的目的不只是掌握儀器的使用操作，更重要的是提高提出問題、分析問題、解決問題的能力。因此，實驗報告除了記錄實驗內容、操作步驟和數據之外，還增加了數據分析和討論兩部分內容。

3 討 論

熒光顯微鏡是生命科學研究中的重要工具，具有直觀性、特異性和可觀測活細胞等特點。然而，熒光顯微鏡分辨率的提高受到光衍射極限的限制。與傳統熒光顯微鏡相比，激光掃描共聚焦顯微鏡的分辨率有了較大的提升，該顯微鏡利用共軛針孔技術減少了非焦平面的信息。依賴激發波長，激光掃描共聚焦顯微鏡的分辨率可達x y軸230 nm，z軸500 nm［22-24］。但是隨著科學研究的深入，激光掃描共聚焦顯微鏡的分辨率已不能滿足科學家們對細胞內精細結構等研究的要求。到20 世紀末，科學家們相繼提出了突破衍射極限的光學顯微成像方法，超高分辨顯微鏡的概念被提出來，這給顯微鏡和科學研究的發展帶來了突破性的進展。實驗教學中加入超高分辨顯微鏡中結構光照明顯微鏡的內容是緊跟科研發展的選擇，這樣不僅使教學可以更好地服務于科研工作，還可以幫助學生拓寬知識面、提升綜合實驗能力。

大型精密儀器具有操作復雜，維護成本高等特點，這使其實驗教學多局限于演示教學。在超高分辨顯微鏡的實驗教學設計上采用小組教學的形式，教師全程指導、嚴格要求、規范操作，給每個學生提供上機操作的機會。教學設計上由淺入深，重視對儀器原理的講解，掌握扎實的理論基礎有助于學習實驗技術。通過設置開放性試驗，培養學生動手操作與獨立思考的能力。開放實驗樣品類型多樣，在圖像采集、參數設置等過程能夠進行有針對性的分析教學，這樣增加了課程的靈活性、趣味性和實用性。在教學中注重經驗總結和反饋教學。比如在實驗過程中發現學生制備的樣品存在統一的問題，蓋片上有多余封片劑等污染物，蓋片位置靠近載玻片邊緣從而影響觀察等。教學中應把學生在樣品制備和實驗操作中常見的錯誤進行總結歸納，并在課程中作為重點進行講解。此外，小組教學給師生間提供了更多的交流機會，學生思維活躍，在課堂中會提出新想法或問題，這對教師的綜合實驗能力和知識面提出了更高的要求，直接促進了教師的自主學習和提升。

4 結 語

在“雙一流”建設的目標下，著力建設了顯微成像儀器的共享平臺，并盡力做到科研教學并重。超高分辨結構光照明顯微鏡在生命科學領域有著重要的作用，該顯微鏡已被廣泛用于細胞內精細結構、蛋白精確定位和活細胞動態觀測等研究中。在實驗課程中加入大型精密儀器的理論和實踐教學具有很強的實用性，同時對于培養學生的綜合實驗能力和創新性思維也有著積極的促進作用。