GC-O和GC-MS結(jié)合鑒定金銀花精油中的特征香氣組分

林德洪，陳 中，張 偉，胡 武，盧真保

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641；2.廣州華芳煙用香精有限公司，廣東 廣州 510530)

金銀花(Honeysuckle)，正名為忍冬(品種來源：LonicerajaponicaThunb.)，如圖1。“金銀花”一詞在《蘇沈良方》中最早出現(xiàn)，且對其形狀特征進行描述，其花初開呈白色，其后變黃。其屬于忍冬屬植物初開的花。在中藥領(lǐng)域，金銀花有重要的價值，也是藥食兩用的食材[1-3]。在我國，金銀花的種植區(qū)域集中在山東、陜西、河南、河北、湖北、江西、廣東等地。

圖1 金銀花

揮發(fā)油是存在于植物體中的一類在常溫下可揮發(fā)的具有芳香氣味的油狀液體總稱。在香料行業(yè)，把揮發(fā)油分成兩類：精油和凈油。精油是指用水蒸氣蒸餾法、壓榨法、冷磨法、干餾法、超臨界萃取、分子蒸餾法從香原料植物器官(如花、葉、枝、籽等)中所制得的含香物質(zhì)的制品。凈油是指用有機溶劑萃取香料植物器官和其滲出物(樹脂、樹膠、香膏)，除去所用的溶劑而得到的香料制品[4]。金銀花香氣濃郁，是清幽型花香香韻，香氣豐富。其揮發(fā)油香韻豐富、特征鮮明。

有關(guān)金銀花的揮發(fā)油成分鑒定多采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)。如林凱[5]采用同時蒸餾萃取法提取福建金銀花揮發(fā)油，用GC-MS法分析鑒定；景延秋[6]等采用GC-MS法，研究了金銀花中揮發(fā)性及半揮發(fā)性成分的種類及含量；孫勝南[7]等用水對金銀花進行提取，用大孔樹脂進行分離水提物，采用GC-MS法分析鑒定金銀花分離物，鑒定出38種成分。彭蓮[8]等應(yīng)用電子鼻技術(shù)與高效液相分析金銀花，研究金銀花氣味與化學(xué)成分之間的相關(guān)性。

二十一世紀(jì)以來，成分鑒定技術(shù)快速發(fā)展。氣相色譜-嗅覺測量法，簡稱GC-O法，嗅香師嗅聞從被測物分解出的成分的氣味，結(jié)合譜圖成分分析推斷、鑒別出相對應(yīng)的花合物，并對氣味特征進行描述評價。GC-O可以鑒別出檢測物的具有獨特氣味的揮發(fā)性成分和不同濃度下各氣味成分對被測物整體香味的影響程度；在特征香味、香味活性化合物等成分鑒定方面具有明顯的優(yōu)勢。Lasekanetal.[9]使用GC-O技術(shù)的稀釋法，從多個蘋果品種鑒別出45個香氣活性物質(zhì)，使用多元統(tǒng)計分析PLS法得出10個關(guān)鍵香氣成分，關(guān)鍵成分主要為對傘花烴、苯甲酸甲酯、己酸甲酯以及乙酸乙酯等。Kraujalyteetal.[10]基于DF法對沙果果汁所含有的香氣活性成分進行分析，分析鑒定出沙果香氣的主要貢獻物來自于己酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、癸酸乙酯、丁酸甲酯以及壬醛等。然而，金銀花揮發(fā)油活性香氣成分系統(tǒng)分析及加香評價應(yīng)用研究鮮見報道。

本實驗采用GC-MS結(jié)合GC-O技術(shù)，分析鑒定金銀花精油的特征香氣組分，建立金銀花精油香氣組分分析研究方法，探索其在煙草行業(yè)的應(yīng)用價值，旨在為金銀花在香料行業(yè)應(yīng)用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器設(shè)備

材料：金銀花為廣東省梅州市種植，采購自廣州市清平藥材市場，見圖2。未加香加料煙絲葉組，廣東中煙工業(yè)公司提供。

試劑：石油醚(沸點 60～90℃)，廣州溶劑廠；乙醚(色譜純)，廣州溶劑廠；乙醇為分析純，蒸餾水。

儀器設(shè)備：流水式中藥粉碎機，溫州鼎歷醫(yī)療器械廠；電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；加熱回流萃取裝置，廣州澤明儀器有限公司；HA-100-0.5型超臨界CO2萃取裝置，江蘇華安科研儀器有限公司；NVP-1000隔膜真空泵，CCA-1112A冷凍循環(huán)水機，N-1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本東京理化器械株式會社；GC7890B-MS5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；ODP2嗅覺測量儀，德國GERSTEL公司。

1.2 方法

1.2.1 材料預(yù)處理

將無破損的金銀花放入烘箱，在50℃下烘5 h，再使用流水式粉碎機粉碎成粉末，并通過80目的篩網(wǎng)進行篩分。

1.2.2 金銀花揮發(fā)油制備

石油醚萃取法。稱取100 g金銀干花粉于2 L燒瓶內(nèi)，按料液質(zhì)量比1∶12加入石油醚，在萃取時間3 h、萃取溫度45℃條件下浸提；過濾取濾液，旋轉(zhuǎn)蒸干，得到金銀花凈油，稱取質(zhì)量。實驗重復(fù)3次，取平均值；記錄提油量。

超臨界CO2萃取法。取100 g金銀干花粉，應(yīng)用超臨界二氧化碳萃取設(shè)備，設(shè)定萃取壓力25 MPa，萃取溫度40℃，CO2流量為20 L/h，分離壓力6 MPa，分離溫度50℃。進行超臨界萃取，收集分離釜的金銀花精油，稱重。每次實驗重復(fù)3次，計算平均提油量。

1.2.3 卷煙加香感官評吸

按照煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，使用金銀花揮發(fā)油進行加香實驗，并運用感官評價法對樣品進行評價。

設(shè)定好添加比例，將稱量好的金銀花凈油和金銀花精油分別以70%乙醇稀釋，分別噴加于未加香加料的煙絲葉組上。將兩組煙葉分別卷成卷煙，放入恒溫恒濕箱中放置48 h以達到平衡。存放參數(shù)設(shè)置為：相對濕度(60±2)℃，溫度(22±1)℃；然后，進行感官評價。

1.2.4 金銀花精油的成分檢測

對超臨界萃取法制備的金銀花精油進行GC-MS和GC-O成分檢測。

1.2.4.1 金銀花精油GC-MS分析

色譜柱：HP-INNOWAX毛細管色譜柱19091N-133i(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度：250℃；進樣量：1 μL，分流比：50∶1；程序升溫：初溫40℃，保持1 min，然后以1℃/min升至150℃保持5 min，再以5℃/min到250℃保持10 min；載氣為高純He，流速1.0 mL/min；傳輸線溫度：260℃；四極桿溫度：150℃；EI電離能量：70 eV；離子源溫度：230℃；掃描方式為全掃描，質(zhì)量掃描范圍30～650 amu；溶劑不延遲。

1.2.4.2 金銀花精油GC-O分析

以乙醚為溶劑，按1∶3、1∶9、1∶27、1∶81、1∶243比例對金銀花精油進行逐步梯度稀釋，并采用GC-O技術(shù)對金銀花精油溶液，進行了稀釋嗅聞分析。

取稀釋液1 μL，注入嗅覺儀分析。一直到評價員在嗅辨器上無法嗅辨出香味，溶液稀釋停止。當(dāng)樣品中的香氣成分未被嗅辨出時，每種香氣活性物質(zhì)的香氣貢獻用所需的最小稀釋因子(稀釋因子)表示。每種香味成分的稀釋因子(FD)是對應(yīng)的最高稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 金銀花揮發(fā)油卷煙加香評吸

2種方法提取的金銀花揮發(fā)油。金銀花凈油呈淺黃綠色，金銀花精油呈淡黃色，均澄清透明，無明顯刺激性，具有金銀花特有香味。金銀花精油具有自然清新的花香，清甜香較明顯，并伴有較輕青滋感、酸香；嗅聞香味較金銀花凈油的甜潤感更足，清香突出。

通過感官評價，判定金銀花揮發(fā)油添加香煙評吸差別(見表1)。按照煙草行業(yè)評價規(guī)定，由煙草評吸小組，分別對添加了金銀花揮發(fā)油的卷煙樣品進行盲評，記錄分值。

在卷煙中加入質(zhì)量比為0.001%和0.005%的金銀花揮發(fā)油，均表現(xiàn)出掩蓋煙草原有的香氣。添加0.001%揮發(fā)油，能增加卷煙香氣量，突出清甜花香；和空白對照煙比較，甜香、果香和藥草香有輕微增加；能有效掩蓋雜氣，提高煙氣豐富性；金銀花精油能諧調(diào)卷煙煙香，細膩飄逸煙氣。同種類的金銀花揮發(fā)油樣品，添加低用量(0.001%)的評價總分高于添加高用量(0.005%)的樣品；添加比例較高的樣品有著較好的增香性、豐富性、清雅度；高比例條件下的金銀花精油，與卷煙的一致性和協(xié)調(diào)性更高。添加低比例的揮發(fā)油的樣品中，超臨界萃取的金銀花精油的評分最高。金銀花精油較凈油更好地提升了煙氣自然清新感、甜潤感。2種金銀花揮發(fā)油，超臨界法金銀花精油更適合用于卷煙加香(見表1和表2)。

2.2 金銀花精油成分GC-MS分析

成分檢測數(shù)據(jù)見圖3和表3。從金銀花精油中共分離出68種化合物，主要由醇類44.48%、烯類16.49%、酸類12.73%、醛類7.88%、酯類6.53%、酮類4.10%等組成；它們的峰面積和共占金銀花精油成分總面積的92.21%；此外，還有少量微量化合物。在鑒定出的成分中，芳樟醇比例最高，占比是10.91%，其次是2-十三醇6.98%，1-二十二烯6.42%，二十九烯5.74%，棕櫚酸4.41%，羥基香茅醛4.30%等。

圖3 金銀花精油GC-MS總離子流色譜圖

表3 金銀花精油的揮發(fā)性成分

表3(續(xù))

表3(續(xù))

2.3 金銀花精油香氣成分GC-O鑒定

在金銀花精油揮發(fā)性成分中，通過嗅辨儀鑒定到香氣物質(zhì)57種(見表4)。金銀花精油整體香氣特征為清香、花香感較重，果香感也比較明顯，并伴有蜜甜香、輕微茴香和酸香。苯乙酸乙酯、苯乙醇、芳樟醇、羥基香茅醛、異戊酸香葉酯、苯甲醛、二氫芳樟醇、香蘭素、壬酸烯丙酯和氧化石竹烯的FD因子較大，都能達到81以上，說明它們可以在濃度極低情況下散發(fā)出強烈的香氣，對金銀花精油香味影響較大。香氣強度最大的物質(zhì)有2種，分別為苯乙醇和羥基香茅醛，稀釋因子均為729，它們是對金銀花精油香味貢獻最大的物質(zhì)。而且，這些組分的香味閾值都很低，苯乙醇的閾值低至0.004～0.007 mg/kg。閾值是指人們通過嗅覺能辨別某種香味時的最低嗅出濃度。一般來說，一個香料的閾值越小，其香氣強度越大。這些組分的閾值低、稀釋因子大，也證明了它們是金銀花精油的重要香氣組分。

嗅香師經(jīng)過反復(fù)聞香，結(jié)合譜圖分析和香味物質(zhì)強度，最終確定了金銀花精油的特征香味物質(zhì)為5種，它們分別為苯乙醇、異戊酸香葉酯、羥基香茅醛、芳樟醇和壬酸烯丙酯。

金銀花精油整體香氣特征為清香、花香感較重，果香感也比較明顯，并伴有蜜甜香、茴香和輕微酸香。而這5種金銀花精油的特征香味組分，其中羥基香茅醛、芳樟醇均帶有青香，主要為清新感的香氣，與整體香氣特征清香相一致；壬酸烯丙酯、異戊酸香葉酯以果甜為主，與整體香氣特征的果香感較一致；苯乙醇具有蜜甜花香，是玫瑰花油的主要成分之一，是配制玫瑰香精和茉莉等花香型香精的“必用成分”；與金銀花整體香氣特征花香、蜜甜香相一致。因此5種金銀花精油的特征香味成分均與金銀花精油整體香氣相協(xié)調(diào)，是構(gòu)成金銀花精油整體香韻的主要貢獻組分。

金銀花精油整體香氣特征為清香、花香感較重，果香感也比較明顯，并伴有蜜甜香、茴香和輕微酸香。而清香、甜香、辛香和果香這些香韻都是卷煙加香上重要的香韻特征，添加在卷煙上，金銀花精油的功能顯著，能起到協(xié)調(diào)煙香，提升煙氣的清甜香和果香，并且增加甜潤感，使煙氣清雅細膩。金銀花精油特征香味組分中，羥基香茅醛、芳樟醇氧化物賦予卷煙清新的香氣，提升煙氣細膩度；壬酸烯丙酯、異戊酸香葉酯以果甜為主，增加卷煙的潤甜感、改善余味；苯乙醇具有蜜甜花香，與煙氣協(xié)調(diào)，提升煙氣飄逸感。由此，將金銀花精油添加在卷煙商，能夠與煙氣協(xié)調(diào)，增加了卷煙香氣量，突出清香，花香、果香和蜜甜香有輕微增加；提高了煙氣豐富度，并能有效將雜氣掩蓋。

表4 金銀花精油香氣組分的香氣強度

表4(續(xù))

3 結(jié)論與討論

采用2種方法提取金銀花揮發(fā)油；添加在卷煙中，金銀花揮發(fā)油均有提高卷煙的清甜花香感、細膩煙氣、提高煙氣豐富性等作用。其中，金銀花精油的評分最高，更好地提升了煙氣自然清新感、甜潤感。對金銀花精油進行GC-MS成分檢測，共檢測出70種化合物；其中，環(huán)氧芳樟醇比例最高，占比是10.07%。GC-O法檢測分析表明，苯乙醇(蜜甜花香)、異戊酸香葉酯(果甜香)、羥基香茅醛(青香)、芳樟醇(花青香)和壬酸烯丙酯(果香)，是金銀花精油的特征香味組分。

對香氣特征組分的綜合分析表明，金銀花精油在卷煙加香上具有很好的應(yīng)用價值。通過對金銀花精油GC-O和GC-MS的綜合分析，確定了金銀花精油的特征香氣及其成分基礎(chǔ)，建立了一套完整的金銀花精油香氣分析研究方法，分析和確定其精油的特殊信息，如香氣閾值，特征香氣組分等，并研究了金銀花精油在卷煙中的應(yīng)用。對于分析金銀花精油的香味性能，了解金銀花精油的香味成分以及每種香味成分對整體香氣特性的貢獻，以及對金銀花香料制品在香料行業(yè)的進一步應(yīng)用具有重要的參考意義。