自催化型石墨烯金納米探針的制備及用于非小細胞肺癌CYFRA211電化學檢測

李瑞怡 儲紅霞 余敏儀 李姝晗 李在均

摘要早期診斷對提高肺癌患者生活質量和延長生存期至關重要。本研究通過熱解檸檬酸與谷氨酰胺的混合物得到谷氨酰胺功能化石墨烯量子點（GlnGQD），所制備的GlnGQD與HAuCI4反應形成GlnGQD/Au復合物。GlnGQD作為還原劑將Au3+轉化為Au0，最終形成Au納米晶體。GlnGQD還作為穩定劑被固定于Au納米晶體的表面，從而實現GlnGQD與Au的雜交。掃描電鏡、透射電鏡、X射線衍射和紅外光譜分析表明，GlnGQD/Au平均粒徑為（31.2±0.15） nm，具有立方金的晶體結構，Au和N元素均勻分布于球形粒子表面，含有豐富的OH、NH、COOH等功能基團。將發夾DNA 2 （H2） 通過AuS鍵連接到Au納米粒子表面，再利用EDC/NHS活化實現GlnGQD的COOH與硫堇（Thi）的氨基縮合，得到H2GlnGQD/AuThi氧化還原探針，基于此構建了無酶放大電化學傳感平臺。在CYFRA211存在下，此傳感平臺的H2可與預先修飾在金電極表面的發夾DNA 1（H1）雜交，釋放出一個CYFRA211分子，所釋放的CYFRA211可直接用于下一次靶DNA循環。通過靶誘導的DNA自組裝鏈式反應，一個CYFRA211靶分子可將多個氧化還原探針固定在金電極表面，從而產生顯著的電化學信號放大效應。H2與H1的雜交實現對靶DNA的特異性響應，Thi在電極表面發生可逆性氧化還原反應， 對靶DNA的響應產生電化學信號，而GlnGQD/Au原位催化Thi的氧化還原反應將進一步放大檢測信號。 CYFRA211濃度在2～100000 fmol/L之間，其差分脈沖伏安峰電流隨CYFRA211濃度增加而線性增大。本方法檢出限為0.67 fmol/L（S/N=3）， 靈敏度明顯優于文獻報道的方法。本方法成功用于人血清中CYFRA211的電化學檢測。

關鍵詞石墨烯金復合物; 氧化還原探針; 自催化作用; 電化學傳感器; 肺癌診斷

1引 言

肺癌是全球發病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1～4]。由于生活方式和社會經濟發展的多樣性，肺癌發病率呈現明顯的地理和性別差異[3]; 此外，肺癌發病還與吸煙、空氣污染和職業等因素有關[4，5]。目前，術后腫瘤治療的主要手段是化療和放療，但化療和放療處理對正常細胞具有嚴重的毒副作用[6]，早期診斷仍是肺癌患者提高生活質量和延長生存期的最佳方案。細胞角蛋白19片段211（CYFRA211）是細胞角蛋白19的可溶性片段，在細胞凋亡過程中釋放到血液中，是惡性腫瘤的常用重要生物標志物[7]。研究表明，肺癌患者的CYFRA211水平與癌胚抗原和神經元特異性烯醇化酶的轉移和活性的關聯性強，近50%患者血清CYFRA 211處于高水平表達[8]。因此，血清CYFRA211成為肺癌早期診斷的重要參考指標[9]。

近年來，多種分析技術被用于檢測與癌癥相關的生物標記物，如蛋白免疫印跡法[10]、免疫細胞化學法[11]、流式細胞術[12]、PCR[13]和電化學傳感器[14]等。蛋白免疫印跡是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學研究常用的實驗技術，通過特異性抗體對凝膠電泳處理后的細胞或生物組織樣品進行染色，然后基于著色的位置和深度，分析特定蛋白質在細胞或組織中的表達情況。該方法靈敏度較低，而且需要使用昂貴儀器[15]。免疫細胞化學是用標記后的抗體或抗原對細胞相應抗原或抗體進行定性、定位或定量檢測的方法。該方法過程繁瑣，且分析周期長[16]。PCR是臨床上識別和定量分析DNA和RNA的常規方法。然而，采用傳統PCR技術檢測復雜DNA混合物中的稀有變異拷貝時只能得到一種平均信號，方法靈敏度較低; 此外，PCR操作較為復雜，需要熟練的專業技術人員[17]。近年來，電化學傳感器檢測與癌癥相關的DNA序列引起極大關注。隨著納米技術和基于DNA信號放大策略的快速發展，電化學傳感技術在靈敏度、選擇性和重現性方面得到進一步提高，成為臨床分析和相關研究的重要手段。然而，肺癌早期的CYFRA 211濃度極低，現有電化學傳感器仍不能滿足早期診斷對靈敏度的需要。

納米金和石墨烯是電分析化學領域常用的納米材料。納米金導電性好、比表面積大、生物相容性好，且具有獨特的催化作用[18]。石墨烯是由六邊形sp2碳原子形成的二維碳材料，具有比表面積大、導電性好、載流子遷移快等優點[19]。最近，金和石墨烯的雜合物成為材料領域的研究熱點[20]。石墨烯金雜交物提供了較單獨納米金和石墨烯更高的催化活性[21]。石墨烯量子點不同于經典石墨烯，由尺寸僅為數納米的石墨烯片組成，具有更大的比表面和更多的功能基團。因此，將納米金和石墨烯量子點結合可進一步提高雜交物的功能性和催化活性[22]。

1電化學檢測

基于DNA的信號放大策略主要包括酶輔助核酸擴增和無酶擴增策略。酶輔助核酸擴增策略常與含有聚合酶、核酸外切酶或內切核酸酶的蛋白質核酸酶單獨或組合使用[23]，然而，酶調節的信號放大可能產生一些非特異性反應，增大了假陽性發生的幾率[22]。近年來，無酶擴增信號放大策略受到青睞，具有更好的穩定性、重現性和可靠性。無酶放大策略主要包括催化發夾DNA組裝[24]、雜交連鎖反應[25]和立足點觸發鏈置換反應[27]。通過DNA序列的合理設計，催化發夾組裝可方便地實現對不同靶DNA的特異性電化學響應，具有高效和穩定的優勢，特別適合構建生物傳感器 [27]。基于納米金石墨烯量子點的特性，將其融入到催化發夾DNA組裝無酶放大策略，有望實現血清CYFRA211的超靈敏電化學檢測。

本研究采用熱解檸檬酸與谷氨酰胺（Gln）的混合物得到了谷氨酰胺功能化石墨烯量子點（GlnGQD），與HAuCl4反應形成GlnGQD/Au雜交物。通過共價健將發夾DNA 2 （H2）和硫堇（Thi）固定到雜交物的表面，得到H2GlnGQD/AuThi自催化型氧化還原探針，用于構建無酶放大電化學傳感器。由于GlnGQD/Au優異的電催化活性和靶誘導的高效無酶循環擴增反應，此電化學傳感器具有超高的靈敏度、選擇性和穩定性，并成功應用于血清中CYFRA211的電化學檢測。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

HITACHI S4800場發射掃描電子顯微鏡（SEM， 日本日立高新公司）; JEM2100（HR）透射電子顯微鏡（TEM， 日本JEOL公司）; D8 Advance X射線衍射（XRD， 德國布魯克公司）; Nicolet iS50 FTIR 傅立葉紅外光譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）; CHI660D電化學工作站（上海辰華公司）。采用三電極系統：Ag/AgCl電極（飽和KCl）、鉑絲和裸金電極或修飾電極（直徑2 mm）分別作為參比電極、對電極和工作電極。 差分脈沖伏安法（DPV）測量電位范圍為0.6～0.2 V，步進電位為4 mV，頻率為25 Hz，幅度為25 mV;? 電化學阻抗譜（EIS）測量的電位幅度為±5 mV，頻率范圍0.01～105 Hz。電化學測量均在室溫下進行，期間保持N2氣氛。

檸檬酸、Gln、氯金酸（HAuCI4）、Thi、三（2羧乙基）膦鹽酸鹽（TCEP）和6巰基己1醇（MCH）（Sigma公司）。0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（Na2HPO4KH2PO4NaClKCl，PBS，pH 7.4）。含有20 mmol/L TrisHCI和0.001 mol/L MgCl2/0.001 mol/L CaCI2/5 0.001 mol/L KCI（pH 7.4）的Tris/Mg/K緩沖液制備DNA儲備溶液，在20℃儲存，備用。使用前，發夾DNA 1（H1）和DNA 2（H2）在95℃加熱10 min，然后以1℃/min緩慢冷卻至室溫，形成穩定的發夾結構。所用DNA核酸序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，堿基序列見表1。其它試劑至少為分析純，購自上海化學公司。實驗用水為MilliQ純水系統純化的超純水（18.2 MΩ cm）。

2.2GlnGQD/Au合成

按1∶0.5摩爾比的檸檬酸和谷氨酰胺混合物，加適量水充分溶解，在80℃下蒸干，然后轉移至高溫烘箱中，180℃熱解3 h，得到谷氨酰胺功能化石墨烯量子點（GlnGQD）。

將氯金酸溶液（0.05 g/L， 49 mL）加熱至沸騰，然后加入GluGQD溶液（50 g/L， 1.0 mL），保持煮沸條件下反應至溶液變為酒紅色，迅速冷卻至室溫，8000 r/min離心8 min，得到GlnGQD/Au雜交物粗品。收集的固體用水洗滌3次，重新分散在1.0 mL TrisHCl緩沖溶液（pH 7.4， 0.05 mol/L）中，得到GlnGQD/Au儲備溶液。

退火處理后的H2溶液（100 μmol/L，20 μL）與TrisHCl緩沖液（20 mmol/L，50 μL，pH 7.4）混合。加入TCEP溶液（2 mmol/L，40 μL）后，攪拌1 h，通過還原斷開因H2暴露在空氣中氧化產生的二硫鍵，實現H1探針中巰基的活化[28]。在攪拌下加入GlnGQD/Au儲備溶液（0.6 mL）。將2 mol/L NaCl和1% SDS分別加入到上述混合溶液中，使最終溶液中SDS和NaCl的濃度分別為0.01%（w/V）和0.16 mol/L。 將此混合溶液常溫孵育24 h， 16000 r/min離心10 min。收集到的沉淀用TrisHCl緩沖液（pH 7.4）洗滌后，重新分散在pH 7.4的TrisHCl緩沖液中。

將H2GlnGQD/Au超聲分散到1.0 mL TE緩沖溶液，加入EDC溶液（20 mg/mL， 10 μL）和NHS溶液（20 mg/mL， 5 μL）， 37℃振蕩（250 r/min）孵育90 min。將活化后的H2GlnGQD/Au與Thi溶液（0.1 mmol/L）混合， 25℃振蕩孵育（250 r/min）過夜， 16000 r/min離心10 min。收集到的H2GlnGQDThi用TrisHCl緩沖液（pH 7.4）洗滌3次，重新分散在TrisHCl緩沖液中， 得到H2GlnGQDThi儲備液， 4℃儲存，備用。

2.4修飾電極的制備

等體積的H1溶液（10 μmol/L）和TCEP溶液（1mmol/L）混合，攪拌1 h，通過TCEP還原斷開二硫鍵，實現H1分子中巰基的活化，用TrisHCl緩沖液稀釋得到0.3 μmol/L H1儲備溶液。將5 μL H1儲備溶液滴加到預處理的金電極表面， 在37℃孵育2 h后，修飾電極用10 mmol/L PBS（pH 7.4，0.1 mol/L NaCl）洗滌，氮氣吹干，然后滴加5 μL MCH溶液（1 mmol/L），室溫孵育1 h，用pH 7.4的PBS溶液洗滌，氮氣吹干，于4℃儲存，備用。

2.5電化學檢測CYFRA211

將CYFRA211標準溶液或血清樣品與H2GlnGQDThi儲備溶液混合，室溫下孵育20 min。將5 μL上述混合溶液滴到已制備的修飾電極表面，室溫下孵育80 min，用10 mmol/L PBS（pH 7.4）洗滌3次，在電化學工作站上測定DPV曲線，電解質溶液為10 mmol/L PBS（pH 7.4，含1.0 mol/L NaCl）。

3結果與討論

3.1H2GlnGQDThi氧化還原探針的合成與表征

H2GlnGQDThi氧化還原探針的合成方案見圖1。首先，通過檸檬酸分子間脫水縮合及隨后的碳化形成由六邊形sp2碳原子組成的二維石墨烯片，再利用Gln分子中的氨基與石墨烯片邊緣的羧基脫水實現GQD的功能化[29]。采取干法熱解制備GlnGQD，石墨烯片的形成與功能化通過一步熱解反應即可完成，方法簡單、高效、環保。然后，GlnGQD與HAuCl4反應合成GluGQD/Au。一方面，GlnGQD作為還原劑，將Au3+轉化為Au0，最終形成Au納米晶體; 另一方面，GlnGQD作為穩定劑，通過其功能基團與Au納米晶體表面的Au+配位形成穩定的親水包覆層[30， 31]。Au納米晶體是良好的導體，而GlnGQD為典型的半導體，因此，二者結合將在界面上產生類似金屬/半導體二極管的結構。通過二極管對電化學檢測信號的放大作用，可提高分析方法的靈敏度。

測定了反應體系的紫外可見吸收光譜和熒光光譜。如圖2A所示，GlnGQD溶液在可見光區域的吸收很弱，無特征吸收峰。加入HAuCl4后，體系在540 nm處出現一個明顯的吸收峰，且峰吸光度值隨反應時間的延長而迅速增大。由于反應體系中只有納米Au可產生特征的可見光區，加入HAuCl4后，體系出現540 nm處吸收峰，表明體系中形成了Au納米晶體，同時也表明GlnGQD能還原Au3+為Au0，最終導致形成納米Au。隨著反應時間延長，形成的Au納米晶體數量迅速增大，導致可見區的吸光度增大。當反應時間超過1 min，吸光度值趨于穩定，說明生成Au納米晶體的反應接近完全。由圖2B可見，加入HAuCl4后，GlnGQD的熒光強度明顯下降。這是因為Au納米晶體有良好的導電性，與GlnGQD結合，將產生一個快速的能量轉移過程，導致GlnGQD 熒光猝滅。隨著反應時間延長，所形成的金納米晶體數量增多，熒光猝滅程度增大。當反應時間超過1 min，體系熒光強度變得十分微弱，并趨于

通過AuS鍵將發夾DNA 2 （H2） 固定在GlnGQD/Au納米粒子表面。考察了GlnGQD/Au在不同濃度H2溶液中孵育24 h的吸收光譜。由圖4可見，GlnGQD/Au在350nm處有一個較強的吸收峰，是GlnGQD/Au中GlnGQD的吸收。當它在H2溶液中孵育后，260 nm處的吸光度（A260 nm）明顯增加。由于DNA的特征紫外吸收峰位于260 nm，上述結果也證明DNA已成功連接到了Au納米晶體表面。隨著H2濃度增加，A260 nm值迅速增大，表明更多的H2固定到了Au納米晶體表面。H2濃度大于100 μmol/L時，A260 nm值趨于穩定，表明Au與H2之間的反應達到平衡。本研究選擇100 μmol/L H2制備氧化還原探針。采用EDC/NHS活化GlnGQD的COOH，與Thi的氨基縮合，得到H2GlnGQD/AuThi氧化還原探針。

3.2CYFRA211電化學傳感平臺

H2GlnGQDThi作為一個自催化型氧化還原探針，用于構建CYFRA211電化學傳感平臺（圖5）。首先，將發夾DNA1（H1）通過AuS鍵固定于金電極表面，用MCH對金電極表面剩余活性位點進行封閉處理。在靶DNA（CYFRA211）存在下，靶DNA與電極表面的H1通過堿基配對進行雜交，導致H1的發夾結構部分打開，能與H2配對的堿基序列暴露。通過堿基鏈置換反應，H2GlnGQDThi與H1雜交產生一個游離靶DNA。釋放的靶DNA繼續打開電極表面處于發夾狀態的H1，打開的H1與H2GlnGQDThi雜交， 重新釋放出靶DNA。通過這種靶DNA誘導的催化發夾DNA自組裝過程，一個靶DNA可以導致很多個H2GlnGQDThi探針結合到電極表面，顯著放大檢測信號。在H2GlnGQDThi中，H2可特異性地與被靶DNA打開發夾結構的H1結合，因此傳感平臺能對CYFRA211產生特異性識別。Thi能在電極表面發生可逆性氧化還原反應，對傳感平臺的識別產生可檢測的電化學信號。GlnGQD/Au具有優異的催化活性，可原位催化Thi的氧化還原反應，實現對檢測信號的放大。基于以上設計，所構建的傳感平臺可對CYFRA211進行高靈敏和高特異性的電化學檢測。

為檢驗本方法測定CYFRA211的可行性，考察了構建過程中電化學傳感平臺的循環伏安（CV）和EIS行為。由圖6可見，裸金電極具有較高的CV電流和較小的電荷轉移電阻（Rct=117.3Ω）。裸金電極表面存在大量金原子，對K3Fe（CN）6的氧化和還原反應具有顯著的催化作用，導致電極反應加快，從而導致CV電流的增加和Rct的下降。相對于裸金電極，H1修飾電極的CV電流明顯減小，Rct增加（371.8 Ω）。這是由于H1帶負電荷的磷酸骨架對Fe（CN）46產生靜電排斥而難以接近電極表面，另一方面，H1的存在堵塞了部分電極與電解質之間進行電子/離子傳輸的通道。當用MCH封閉電極后，電極表面更多的活性位點被MCH所占據， Ret（1169 Ω）大幅增加。 不存在靶DNA時，H2GlnGQDThi不能與電極上的H1結合進入電極的表面，傳感器的CV響應和Ret值（1122 Ω）基本保持不變。靶DNA存在時，由于H2GlnGQDThi被引入到電極表面，CV電流明顯增加，Rct值大幅度下降（468.4 Ω）， 由于H2GlnGQDThi作為自催化型氧化還原探針產生了靈敏的電化學響應。上述結果還表明，只有靶DNA才能開啟發夾自組裝鏈式反應，實現對CYFRA211的高靈敏和高特異性電化學響應。

3.3檢測條件的優化

考察了H1濃度和孵化時間對DPV峰電流的影響。如圖7所示，當H1濃度小于0.5 μmol/L時，DPV峰電流值隨H1的濃度增加而迅速增大。當H1濃度低時，固定在電極表面的H2GlnGQDThi探針數量主要取決于電極表面H1的數量。隨著H1濃度增加，固定在電極表面的H2GlnGQDThi探針數量將增多，從而產生更大的DPV電流。當H1濃度達到0.5 μmol/L時，DPV響應趨于穩定。因為H1的數量與通過靶誘導的DNA循環反應在60 min內能固定到電極表面的H2GlnGQDThi數量接近。繼續增加H1濃度也不能繼續增加固定在電極表面的H2GlnGQDThi數量。由圖7B可見，當孵化時間小于60 min時，DPV峰電流隨孵化時間的延長而迅速增大。當孵育時間超過60 min，峰電流不再增加， 說明電極表面H1已完全與H2GlnGQDThi雜交。后續實驗選擇0.5 μmol/L H1孵育60 min。

3.4方法的分析性能

電化學傳感平臺在不同濃度CYFRA211下的DPV行為見圖8。隨著CYFRA211濃度的增加，修飾電極的DPV電流逐漸增大（圖8A）。DPV峰電流與CYFRA211濃度對數值的關系曲線如圖8B所示。當靶DNA濃度在2～100000 fmol/L之間，DPV峰電流（Ip）與CYFRA211濃度的對數值（lgCDNA）呈現良好的線性關系，線性回歸方程為Ip= 314.43lgCDNA +1233.3（R2=0.9988），方法檢出限（S/N=3）為0.67 fmol/L。所構建的電化學傳感器測定CYFRA211具有高的靈敏度，優于現有文獻報道的同類傳感器[32～36]。

采用相同的方法制備10個傳感器，測定1.0×1012mol/L CYFRA211響應電流的相對標準偏差（RSD）為3.3%，表明傳感器制備重現性良好。 采用同一個傳感器測定1000 fmol/L CYFRA211，20次重復測量的RSD為2.8%，表明傳感器重現性好。將制備的傳感器在4℃儲存30 d后，傳感器對1.0×1012mol/L CYFRA211的DPV峰電流響應為原始響應值的974%以上，表明此傳感器具有高的長期穩定性。

選擇單堿基錯配DNA序列（SmDNA）、三堿基錯配DNA序列（TmDNA）和非互補DNA序列（NDNA），測試傳感器對靶DNA（TDNA）CYFRA211的特異性。由圖 9可見，NDNA引起的DPV峰電流值與空白PBS相當，說明傳感平臺對NDNA不能識別。相對于NDNA，TmDNA和SmDNA引起了明顯的DPV峰電流響應。TmDNA和SmDNA與TDNA僅存在少量堿基序列差異，同樣具備開啟催化發夾DNA自組裝過程的功能，引起較小的電化學響應。然而，堿基錯配將大幅度降低TmDNA或SmDNA與H1雜交反應速率，嚴重制約靶誘導催化發夾DNA自組裝過程的開啟，從而導致引入到電極表面的H2GlnGQDThi探針數量很少，因此僅引起較小的DPV電流響應。由圖9可見，TDNA產生的DPV峰電流值明顯高于其它DNA序列，表明此電化學傳感器測定CYFRA211具有良好的選擇性。

3.5血清樣品CYFRA211測定

將構建的電化學傳感平臺用于人血清樣品中CYFRA211的測定，血清樣品中未檢出CYFRA211，200 fmol/L水平的加標回收率為100.4%，表明本方法具有較高的準確性。

4結 論

針對肺癌早期診斷技術靈敏度不足的問題，本研究設計合成了含發夾DNA 2、GlnGQD/Au和Thi的自催化型氧化還原探針，結合無酶放大策略，構建了CYFRA211電化學傳感平臺。探針的發夾DNA 2（H2）對靶DNA（TDNA）的識別產生特異性響應，利用Thi的氧化還原反應對識別靶DNA的響應產生電化學信號，GlnGQD/Au原位催化Thi的氧化還原，實現響應信號的放大。自催化氧化還原探針的設計，可改善電化傳感器的特異性和靈敏度; 此外，自催化型氧化還原探針與無酶放大策略的結合進一步提高了方法的靈敏度。基于氧化還原探針和無酶循環擴增的雙重信號放大，所構建的電化學傳感平臺對CYFRA211靈敏度高，有望在肺癌早期診斷中得到應用。

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