不同烤煙品種煙葉氨基酸代謝差異分析

李洪臣　朱順成

摘要：為篩選優質烤煙品種，明確烤煙品種間煙葉氨基酸代謝差異情況，研究了豫煙10號、NC89和中煙100 3個品種煙葉生長過程中脯氨酸、谷氨酸和天冬氨酸代謝關鍵酶活性及氨基酸含量動態變化。結果表明，葉齡20 d時，Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶、鳥氨酸轉氨酶、脯氨酸脫氫酶、天冬氨酸轉氨酶和天冬氨酸激酶活性均呈先升高后降低趨勢，峰值在葉齡30～40 d，豫煙10號酶活性最高;煙葉中脯氨酸含量不斷增加，葉齡30 d后，豫煙10號脯氨酸含量最高。游離氨基酸含量呈先升高后降低再升高趨勢，在葉齡各時期豫煙10號均最高。

關鍵詞：烤煙;煙葉;氨基酸;酶活性

中圖分類號：S572 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）05-0088-04

Abstract： To screen high-quality flue-cured tobacco varieties and clarify the differences in amino acid metabolism among flue-cured tobacco varieties， the dynamic changes of proline， glutamic acid and aspartic acid metabolism key enzyme activities and amino acid content during the tobacco leaf growth of Yuyan 10， NC89 and Zhongyan 100 were studied. The results showed that at 20 days of leaf age， the activities of Δ1-pyrroline-5-carboxylic acid synthetase， ornithine aminotransferase， proline dehydrogenase， aspartate aminotransferase and aspartate kinase all increased first and then decreased， the peak is at leaf age 30～40 d， Yuyan 10 had the highest enzyme activity; the content of proline in tobacco leaves increased continuously; after 30 days of leaf age， the content of proline in Yuyan 10 changed to highest. The content of free amino acids increased first， then decreased and then increased， and Yuyan 10 was the highest at each stage of leaf age.

Key words： flue-cured tobacco; tobacco leaf; amino acid; enzyme activity

氨基酸是煙草中重要的含氮化合物，也是香氣的主要來源之一[1]。在煙葉生長、烘烤和醇化過程中，氨基酸與還原糖發生非酶促棕色化反應（美拉德反應）是煙草中重要的致香反應，可形成對煙草香味有重要影響的吡咯、吡嗪和呋喃等物質，苯丙氨酸等部分氨基酸還可以直接分解為苯甲醇、苯乙醇等香味物質[2，3]。研究表明，添加天冬氨酸和脯氨酸等調控美拉德反應程度，可使煙香濃郁，香氣醇和細膩，降低刺激性，改善余味[4-6]。煙葉游離氨基酸含量與感官品質總體呈負相關，且煙葉游離氨基酸含量在烘烤過程先上升后大幅下降[7]。煙葉生長過程中合成更多的氨基酸參與美拉德反應，有利于改善煙葉感官質量。煙葉中氨基酸含量較高的為脯氨酸、谷氨酸和天冬氨酸[8]，在多種酶的作用下合成與降解。煙葉中氨基酸代謝動態變化鮮見報道，品種間氨基酸代謝差異尚不明確。試驗從氨基酸代謝關鍵酶入手，研究了不同品種煙葉氨基酸動態變化情況，以期為篩選優質烤煙品種提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?供試材料

試驗在河南農業大學科教園區開展，土壤為壤質潮土，耕層含有機質9.38 g/kg、全氮1.22 g/kg、速效氮76.57 mg/kg、速效磷27.48 mg/kg、速效鉀84.39 mg/kg，pH 7.70。供試烤煙品種為豫煙10號、中煙100和NC89。

1.2 ?試驗設計

試驗采用隨機區組設計，每個品種100株，重復3次，行株柜為120 cm×50 cm，氮肥施用量為45 kg/hm2、磷肥施用量為90 kg/hm2、鉀肥施用量為135 kg/hm2，所用肥料為硝酸銨、重過磷酸鈣和硫酸鉀。5月10日施入基肥，6月10日追肥，基追肥比為7∶3。其他田間管理及病蟲害防治均按優質煙生產技術方案進行。

1.3 ?測定項目及方法

選取整齊一致的單株，以中部葉10～12片葉（自下向上數）為研究對象，以葉長1.5 cm時開始掛牌計算葉齡，分別于葉齡20、30、40、50 d、烘烤前（60 d烘烤）取樣，各品種重復取樣3次，用冰盒帶回實驗室，測定氨基酸代謝相關指標。

Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）活性的測定參照文獻[9，10]的方法，利用鹽酸羥胺比色法測定;鳥氨酸轉氨酶（δ-OAT）活性的測定參照文獻[11]的方法;脯氨酸脫氫酶（ProDH）活性的測定參照文獻[12]的方法;脯氨酸含量的測定采用酸性茚三酮法[13，14];天冬氨酸轉氨酶（AAT）活性的測定參考文獻[15]的方法;天冬氨酸激酶（AK）活性的測定參考文獻[16]的方法;游離氨基酸總量的測定采用茚三酮顯色法[17]。

1.4 ?數據處理

采用SPSS 17.0數據處理系統和Microsoft Excel 2010軟件對數據進行分析和作圖。

2 ?結果分析

2.1 ?不同品種Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶活性的差異

Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）是谷氨酸合成途徑中的限速和調節酶[18]。由圖1可知，P5CS的活性在葉齡20～30 d大幅升高至峰值之后下降，在葉齡30～50 d大幅下降。豫煙10號的P5CS活性高于其他品種;NC89最低且峰值平穩，變幅不大。品種間P5CS活性存在差異，P5CS活性較高的品種脯氨酸合成能力較強。

2.2 ?不同品種鳥氨酸轉氨酶活性的差異

鳥氨酸轉氨酶（δ-OAT）是調節脯氨酸合成途徑中鳥氨酸途徑的核心關鍵酶[19]。由圖2可知，δ-OAT的活性在葉齡20～40 d大幅升高至峰值之后下降，在葉齡40 d至烘烤大幅下降。豫煙10號的δ-OAT活性高于其他品種，NC89最低。品種間δ-OAT活性存在差異，δ-OAT活性較高的品種脯氨酸合成能力較強。

2.3 ?不同品種脯氨酸脫氫酶活性的差異

脯氨酸脫氫酶（ProDH）是脯氨酸降解的限速酶[20]。由圖3可知，ProDH的活性在葉齡20～30 d大幅升高至峰值之后下降，在葉齡30 d至烘烤前大幅下降。葉齡20～30 d豫煙10號的ProDH與NC89差異不大，中煙100最高;葉齡40～50 d豫煙10號顯著低于其他品種，NC89最高。品種間ProDH活性存在差異，ProDH活性較高的品種脯氨酸降解能力較強。

2.4 ?不同品種脯氨酸含量的差異

脯氨酸的積累一部分來源于酶的作用，另一部分來自蛋白質的降解，成熟后期積累量與逆境抗性有關[21，22]。由圖4可知，脯氨酸含量不斷上升，在葉齡20～40 d增幅較小，在葉齡40 d至烘烤前大幅升高。葉齡20～30 d豫煙10號的脯氨酸含量最低;葉齡40～50 d豫煙10號最高，中煙100與NC89相差不大，葉齡50 d至烘烤前含量大幅升高。品種間脯氨酸含量和積累存在差異，豫煙10號脯氨酸含量較高。

2.5 ?不同品種天冬氨酸轉氨酶活性的差異

天冬氨酸轉氨酶（AAT）是天冬氨酸家族氨基酸合成的關鍵酶[23]。由圖5可知，AAT的活性在葉齡20～30 d升高至峰值之后下降，在葉齡30 d至烘烤前大幅下降。葉齡20～30 d豫煙10號的AAT活性顯著高于其他品種，中煙100與NC89差異不大;葉齡40～50 d豫煙10號與NC89相差不大，中煙100最低。品種間AAT活性存在差異，AAT活性較高的品種天冬氨酸家族氨基酸合成能力較強。

2.6 ?不同品種天冬氨酸激酶活性的差異

天冬氨酸激酶（AK）也是合成天冬氨酸家族氨基酸的關鍵酶[23]。由圖6可知，AK的活性在葉齡20～40 d大幅升高至峰值之后下降，在葉齡40 d至烘烤前大幅下降。葉齡20～40 d豫煙10號的AK活性大幅升高，由最低轉變為最高，并顯著高于其他品種，中煙100與NC89差異不大;葉齡40～50 d豫煙10號活性最高，NC89最低。品種間AK活性存在差異，AK活性較高的品種天冬氨酸家族氨基酸合成能力較強。

2.7 ?不同品種游離氨基酸總量的差異

游離氨基酸既是合成蛋白質的原料，又是蛋白質降解的產物。由圖7可知，游離氨基酸總量在葉齡20～40 d升高至峰值之后下降，在葉齡40～50 d大幅下降，之后在烘烤前有小幅的上升。豫煙10號的氨基酸含量高于其他品種，NC89最低。品種間游離氨基酸總量存在差異，這與氨基酸代謝酶和蛋白質的降解作用有關。

3 ?小結與討論

氨基酸以游離狀態存在于煙葉中，在煙葉調制過程中，有些氨基酸降解產生煙葉香氣前體物，而有些轉化成揮發性羰基化合物[24]。豫煙10號的P5CS和δ-OAT活性高于其他品種，NC89最低且峰值平穩，變幅不大。煙葉中存在以谷氨酸（Glu）和鳥氨酸（Orn）為底物合成脯氨酸的兩條途徑，即谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑。P5CS和δ-OAT分別是兩條合成途徑的關鍵酶。脯氨酸的降解由2個連續的線粒體酶催化，即ProDH和P5CDH，其中ProDH是脯氨酸降解的限速酶[25]。因此品種間P5CS、δ-OAT和ProDH活性存在差異，活性較高的品種豫煙10號脯氨酸合成能力較強，煙葉的脯氨酸含量也證明了這一點。

天冬氨酸家族氨基酸包括天冬氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸和異亮氨酸。天冬氨酸家族氨基酸合成的關鍵酶是AAT和AK。葉齡20～30 d，豫煙10號的AAT和AK活性顯著高于其他品種，中煙100與NC89差異不大;葉齡40～50 d，豫煙10號與NC89相差不大，中煙100最低。已有研究也表明，過量表達AAT基因天冬氨酸家族氨基酸的含量顯著提高，AK主要調節賴氨酸合成。同時，AK活性高對蛋氨酸、蘇氨酸與異亮氨酸積累有利[26，27]。品種間AAT和AK活性存在差異，AAT和AK活性較高的品種天冬氨酸家族氨基酸合成能力較強。

豫煙10號的游離氨基酸含量高于其他品種，NC89最低。結合相關氨基酸代謝的酶活性與脯氨酸含量的變化，品種間氨基酸含量存在差異，這與氨基酸代謝酶有關，同時也與蛋白質的降解作用有關。

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