載脂蛋白AI和B在脂肪肝中的調節作用

高穎

摘要 為研究載脂蛋白AI（apoAI）和載脂蛋白B（apoB）在脂肪肝中的調節作用，采用原代肝細胞體外培養來培養大鼠肝細胞。正常貼壁培養的肝細胞分別用1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L的DL-乙硫氨酸處理，在24、48 h時測定對照組及處理組細胞裂解液中apoAI、apoB、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）的含量。結果表明，肝臟極低密度脂蛋白（VLDL）的合成限速關鍵物質是apoB，而VLDL又對甘油三酯（TG）起主要輸出作用。apoB的降低可能是肝臟脂肪變性發展的重要因素，因此確立apoB作為脂肪性肝炎的預測指標。

關鍵詞 細胞培養;脂肪肝;載脂蛋白;脂蛋白

Abstract In order to investigate regulating metabolism of apoAI，apoB on fatty liver， rat hepatocytes were cultured by the method of primary cultured hepatocytes in vitro culture. The normal adhered hepatocytes were treated with 1.0， 2.0， 3.0， 4.0， 5.0 mmol/L DLethionine and the concentration of apoAI， apoB， LDL， HDL in cell lysate for 24 and 48 hours between treating respectively were measured. The results showed that VLDL was a major terminal route of lipoprotein B in the liver， and composition of apoB was the compositive ratelimiting step in VLDL. The significant factor of liver fatty degeneration incriminated apoprotein B degrading， thus apoB was established as a preindex on nonalcoholic steatohepatitis.

Key words Hepatocyte culture;Fatty liver;Apoprotein;Lipoprotein

載脂蛋白、細胞膜脂蛋白受體、脂代謝酶是介入脂蛋白代謝過程的主要因素，這是一個復雜的相關聯的動態過程。載脂蛋白是血漿脂蛋白的主要成分，而apoB參與低密度脂蛋白受體（LDLR）的識別，是構成其的主要蛋白質。LDL 通過apoB 與 LDLR 結合進入細胞內，抑制內源性膽固醇的合成并降低 LDLR 數目，對膽固醇代謝起著自我反饋的作用[1-2]。因此，載脂蛋白對血漿脂蛋白的代謝效率起控制性作用。筆者通過體外培養肝細胞、添加藥物、生化指標測定等方法來檢測肝細胞內載脂蛋白和脂蛋白的含量變化，分析載脂蛋白對調節脂蛋白、甘油三酯含量的作用，從新的角度展開載脂蛋白在體內對脂代謝相互作用的研究，以期為藥物研發提供新的實驗手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物。

SD大鼠，雄性，100～150 g，清潔級，健康，由河北省實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑。

根據參考文獻[3-5]配制預灌流液、細胞洗液，培養基，預熱至37 ℃，備用。載脂蛋白AI試劑盒、載脂蛋白B試劑盒、直接高密度脂蛋白試劑盒、直接低密度脂蛋白試劑盒，置于室溫下備用。

1.1.3 主要儀器。

二氧化碳恒溫培養箱，為日本SANYO公司產品;超凈工作臺，為德國Heraeus公司產品;倒置相差顯微鏡成像系統，為OLYMPUS公司產品;24孔細胞培養板，為NUNC公司產品;A-6型半自動生化分析儀，為北京松上技術有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 原代肝細胞的分離與培養。

取成年SD大鼠，速眠新麻醉，采用二步灌流法獲取肝細胞[6-10]。用200目尼龍網布過濾，收集濾液，以800 r/min離心3 min，去上清液，將肝細胞加入培養基中重新懸浮，用移液管吹打幾次，混勻，再次離心，重復2次。計數板染色，觀察細胞總數和細胞活力，24孔板鋪入細胞，二氧化碳恒溫培養箱中培養24 h。

1.2.2 DL-乙硫氨酸處理大鼠肝細胞。

待細胞附著貼壁培養24 h后，用倒置相差顯微鏡觀察細胞生長情況。用1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L DL-乙硫氨酸處理貼壁生長良好的肝細胞，分為對照組（A）和處理組（B、C、D、E、F），每組6個重復，24 h換液1次。將細胞與裂解液一并轉入離心管，混勻，12 000 r/min離心10 min，取上清液待測。

1.2.3 生化指標測定。

按照試劑盒說明書，利用生化分析儀分別測定A、B、C、D、E、F組24和48 h細胞裂解液中apoAI、apoB、LDL、HDL的含量。

1.2.4 數據統計與分析。

采用單因子方差分析（One-way ANOVA），0.01

2 結果與分析

2.1 DL-乙硫氨酸對apoAI和apoB含量的影響

肝細胞中測定的生化指標結果表明，DL-乙硫氨酸作用24 h時，處理組各組apoAI含量與對照組差異極顯著（0<P<0.01）;處理組B、C、D、E組apoB含量與對照組差異極顯著（0<P<0.01），F組與對照組差異不顯著（P>0.05）。作用48 h時，處理組各組與對照組apoAI、apoB含量差異極顯著（0<P<0.01）（表1）。

2.2 DL-乙硫氨酸對LDL和HDL含量的影響

肝細胞中測定的生化指標結果表明，DL-乙硫氨酸作用24 h時，處理組各組LDL含量與對照組差異極顯著（0

3 討論

肝細胞分解代謝脂蛋白與細胞膜上的脂蛋白受體結合物受載脂蛋白的影響。血液不能直接轉運疏水性物質，其也不能直接進入組織細胞中，因此甘油三酯和膽固醇都必須與血液中的特殊蛋白質和極性類脂合成脂蛋白，以便在血液中運輸并進入肝細胞。肝內的脂蛋白被VLDL運到肝外組織去貯存和利用。

該試驗中apoAI和apoB含量的變化趨勢，分別與HDL、LDL的變化相關。肝臟內蛋白質的合成障礙減少了負責將TG轉運出肝臟的載脂蛋白B的復合物，從而使VLDL轉運不出去，TG含量升高，DL-乙硫氨酸代替甲基而提供乙基就是利用了這一點。apoAI和HDL的含量隨著DL-乙硫氨酸濃度的增加而升高。HDL的合成場所主要在肝臟內，當乳糜微粒（CM）和VLDL中的甘油三酯水解時，apoAI脫離其表面形成HDL。apoA是運輸HDL的主要載脂蛋白，這證實了apoAI的含量越高，形成的HDL也越多。apoB控制著VLDL的轉運，當apoB含量下降時肝細胞內的VLDL含量增加，TG含量也升高。

載脂蛋白B的相關性研究用于心血管疾病、脂蛋白血癥、肥胖和膽囊疾病的臨床應用更加實用化，為患者提供早期預測、實施正確的治療方案和進行治療效果的評估奠定基礎。

參考文獻

[1] 袁立英，趙瑾，羅德紅，等.腎臟疾病中載脂蛋白A1、載脂蛋白B測定及其臨床意義[J].中國社區醫師，2017，33（27）：124-125.

[2] 楊開燕，鐘栩，盧玉俊，等.血漿載脂蛋白的研究進展[J].臨床薈萃，2012（14）：1268-1271.

[3] 徐叔云，卞如濂，陳修，等.實驗藥理方法學[M].北京：人民衛生出版社，2002：5812-5841.

[4] SEGLEN P O.Isolation of hepatocytes by collagenase perfusion[J].In vitro biological systems，1993，1：231-243.

[5] PICHARD L， RAULET E， FABRE G， et al.Human hepatocyte culture[J].Methods in molecular biology， 2006，320：283-293.

[6] MAKABEL B， ZHAO Y Y，WANG B， et al.Stability and structure studies on alisol a 24-acetate[J].Chem Pharm Bull， 2008，56（1）：41-45.

[7] 周星輝，王丙力，譚煥然.大鼠肝實質細胞原代培養模型的研究及其功能鑒定[J].中國臨床藥理學與治療學，2005，10（7）：743-746.

[8] 徐哲，白雪帆，滕光菊，等.大鼠肝細胞分離、原代培養及生物學特性研究[J].醫學研究生學報，2003，16（5）：342-344，351.

[9] NAKAGIRI R，ODA H，KAMIYA T.Small scale rat hepatocyte primary culture with application for screening hepatoprotective substances[J].Biosic Biotechnol Biochem，2003，67（8）：1629-1635.

[10] 徐旭，席文恭，于冰，等.乙硫氨酸對小鼠脂肪代謝影響的研究[J].實驗動物科學，2009，26（5）：5-6.