梨果實香氣物質的研究綜述

張 軍，李靖靖

(鄭州工程技術學院 化工食品學院，河南 鄭州 450044)

梨是人們最喜愛的水果之一，其獨特的香氣是構成梨品質的重要因素。作為世界四大水果之一，全世界有 88 個國家和地區生產梨[1]。栽培品種分為東方梨或亞洲梨和西洋梨兩大類[2]。據美國農業部海外農業服務局提供的數據顯示，2017年全球鮮食梨產量達到2530萬t，中國梨產量達到1930萬t[3]。隨著產品的大量供給和人們需求價值的提高，對品質追求從外觀、口感等轉向內在的、隱性的品質，消費者愈發重視果實的香氣品質。因此，果實香氣品質成為近年來水果產業的重要的熱點研究領域之一。

1 梨果實香氣的研究思路和態勢分析

果實的香氣是評價果實品質的重要指標之一。近年來，對水果(蔬菜)香氣品質的研究受到國內外學者的廣泛關注。水果(蔬菜)的揮發性氣味被人們稱作芳香性氣味，也稱之為果實的香氣。評價果實品質的主要指標通常有個頭大小、表面完好程度、顏色、耐貯性等，而對果實香氣品質評價卻一直沒有確定的、明晰的評定方法。

早在1927年，Harley和Fisher 通過熱崩解有機化學物質的方法(逆向假定)研究發現Bartlett梨揮發性氣體中含有乙醛，拉開了人們研究梨果實香氣成分的序幕。隨后的1938年，Tindale 等發現Bartlett梨揮發性氣體中除了含有乙醛外還有乙醇，并隨著貯藏時間而變化。1952 年，英國科學家Martin 和 James 發表用氣相色譜分離低碳數脂肪酸、揮發性胺等的方法，這標志著氣相色譜法正式進入歷史舞臺。1955年第一臺商品氣相色譜儀的推出[4]是科學家研究痕量氣體的里程碑事件，從此人們對果實揮發性氣體(香氣)的研究進入了一個嶄新時代——從模糊假定推測到精確定性定量。1956年，Mehlitz 和 Matzik 使用氣相色譜法研究了不包括Bartlett梨在內的其他幾種梨果實中揮發性酸和酯的含量，Jennings W在1961年使用同樣的方法再次研究了Bartlett梨，定性定量了大量的酯等成分。由于氣相色譜的使用，在1962年Drawert研究了梨果實中甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇、異丁醇、正丁醇、正戊醇、2-甲基丙醇、甲基丁醇、正己醇酯等等。1970年， Nursten 證明了癸二烯酸酯是Bartlett梨的特征香氣成分或定義為“賦予食品獨特香氣的化合物”。自此，對于果實香氣的研究由定性定量進入了特征成分確定階段。自1990年Paillard 發表了關于蘋果、梨、榅桲的風味的文章后，對于西洋梨和東方梨的香氣研究越來越多。雖然已有50多個栽培品種梨屬植物，已鑒定出300多種化合物，包括烴類、醛類、醇類、酯類、酮類和含硫化合物等，但是相對于蘋果、桃、草莓、香蕉，梨果實香氣的研究仍然較少。

隨著基因組學和代謝組學等理論的發展以及GC-MSMS等超痕量檢測技術的應用，結合QTLs 分析技術、基因芯片和 RNA seq 等信息處理高新技術的廣泛應用，香氣物質代謝過程中的關鍵酶及調控因子不斷得到明確，克隆和分離果實香氣的相關基因不斷取得相應成果。常見諸報端的研究有蘋果、草莓、番茄等，而鮮有對梨果實香氣的代謝研究。1975年Strandjev研究了東方梨，1990年Haruyasu研究了西洋梨在成熟及其貯藏過程中香氣的動態變化，開始了梨果實香氣的動態研究。1998年美國芝加哥大學Natilia Dudareva成功克隆了仙女扇花香氣的BEAT基因；1999年Christian Chervin研究了梨成熟過程中乙醇脫氫酶基因表達和乙醇產生的關系，發現乙醇脫氫酶(ADH酶)是果實香氣合成過程中重要的酶。從此，對果實香氣的探索進入到生化及分子層面。

我國對果實香氣的研究相對較晚，1991年張富春[5]研究了獼猴桃的香氣成分是果實香氣研究的起點；1992年梁蓮莉[6]開始對薔薇科刺梨果實香氣進行研究。從此，有多人對各種梨的香氣進行了定性定量分析。2014年，廖鳳玲[7]開始研究梨香氣的生理機制，巴金磊[8]研究了梨果實香氣的α-法尼烯基因，Li G等[9]研究酯類與香氣相關基因；2016年，Wei S等[10]通過轉錄組揭示了與香氣代謝和釋放相關基因；2017年，王龍[11]研究了梨果實在冷藏條件下酯類香氣物質代謝途徑關鍵酶活性及蛋白表達水平的變化。1992—2017年，國內科學家用25年的時間完成了歐美等國對梨果實香氣90年(1927—2017年)的研究歷程。

使用Web of Science選擇所有數據庫，檢索關鍵詞“pear & aroma”，得到174篇國內外對梨果實香氣的研究結果，其中研究論文占170篇。使用中文知網檢索關鍵詞“梨and香氣”，共有學術論文390篇，主要集中在2010年以后。綜上，國內外科學家對于果實香氣的研究按照香氣成分定性定量、果實特征香氣的確定、香氣成分的前體物質、代謝機制及分子機理這一路線實現。

2 梨果實香氣的成分及其研究方法

目前，已經鑒定出不同品種梨果實中300多種香氣化合物，按香氣化合物的結構特點可以分為酯類、醛類、醇類、酮類、酸類等五類揮發性物質。不同的果實品種中這些揮發性化合物的種類和比例各不相同，構成了果實特有的香氣特征。有研究認為，酯類是西洋梨特征水果味或聞起來香甜的香氣揮發性成分[12]，構成西洋梨果實特征香氣成分是己醛、己酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸己酯、乙酸己酯、丙酸乙酯等[13]，其中辛酸乙酯給予梨果實有甜蜜的嗅感。李國鵬[14]等認為東方梨香氣成分主要有丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯、己醛、己烯醛、α-法尼稀等。

對于含量微小的果實香氣的鑒定是隨著高精密儀器的發展而被確認的。隨著GC-MS等精密儀器的出現，香氣成分的研究也更加深入廣泛，而對于香氣成分的采集(萃取)或香氣分析的前處理方法成為決定該項研究的關鍵步驟。通常，對于氣態揮發性化合物的富集一般有以下幾種方法：

(1)同時蒸餾萃取法(SDE)。利用揮發性氣體樣品(蒸汽)和萃取劑蒸汽在密閉的裝置中充分混合，組分在低于各自沸點時被蒸餾出來，樣品揮發性成分首先被蒸餾出來，然后和萃取劑在冷凝管中完成萃取分離。SDE法的優點是將樣品和溶劑萃取兩步過程合二為一，與傳統的水蒸氣蒸餾方法相比，減少了實驗步驟，節約了大量溶劑，同時也降低了樣品在轉移過程中的損失。在揮發性氣體研究方面一直被人們使用，如張鳳芳等[15]使用SDE提取蔥的揮發性成分，Hong J H等[16]對柑橘香氣進行研究。對梨果實香氣的應用也多有報道，如使用SDE前處理結合GC-MS研究東方梨的香氣、結合GC-MS研究La France pear成熟時的香氣成分，等等。

(2)超臨界萃取法(SFE)。以二氧化碳等氣體為萃取載體，因其安全、性質穩定，常用于食品的分析[17]。果實的揮發性香氣多部分是非極性的小分子化合物，二氧化碳是其優良的溶劑，對果實香氣的研究也常見于報道，如Stefano等[18]對草莓的香氣進行分析，Lacassie等[19]使用SFE萃取技術用GC-MS分析了梨等果實的香氣，婁在祥等[20]研究了庫爾勒香梨的香氣精油成分。

(3)固相微萃取法(SPME)。該法是應現代儀器的要求而產生的樣品前處理新技術，集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體，真正實現樣品的現場采集和萃取。設備小巧，攜帶方便，能夠與各種色譜及色質等精密分析儀器聯用。1989年加拿大Waterloo大學的科學家Pawliszyn提出了該新型樣品前處理技術原理，1993年美國Supelco公司取得專利并商品化，且于1994年獲美國匹茲堡分析儀器會議革新大獎，該技術在近十幾年內受到了廣泛的關注。該方法的基本原理是將各種樣品中揮發性化合物直接吸附到一根帶有吸附劑涂層的熔融石英纖維上，依照“相似相溶”原理對有機物進行吸附，從樣品中將組分萃取出來，逐漸富集，然后解吸分析物至相連接的分析檢測設備。固相微萃取的核心是萃取裝置石英纖維上的吸附劑涂層，目前有兩類：一類是均相聚合物涂層，如聚二甲基硅氧烷(PDMS)和聚丙烯酸酯(PA)，其中PDMS是一種高黏度橡膠狀液體，PA涂層呈固態水晶狀，在解析溫度下可轉變為液態，二者均屬高黏性液相涂層，作用是吸收萃取待測物；另一類是多相多孔聚合物涂層，如聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)、聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯/碳分子篩(PDMS/DVB/CAR)等，這一類為固相涂層，作用是以吸附機理進行萃取[21]。該技術設備裝置結構簡單，小巧緊湊，形狀像一只醫用注射器，由手柄和萃取頭兩部分構成。萃取頭頂端涂有不同類型吸附劑的熔融石英纖維頭，用于萃取、吸附樣品，手柄用于安裝或固定萃取頭，可永久使用。隨著萃取吸附劑材質的改進，新型涂層不斷被發明和應用， SPME 技術越來越廣泛地應用于環境、食品、醫藥化工等多個領域。對于果實香氣(揮發性氣體)的研究比較多，Giannetti等[22]對蘋果香氣進行研究，Cuevas等[23]研究鮮橙的香氣成分，張涵等[24]研究對比了我國常見的4 種主栽柑橘類香氣，周立華等[25]研究了7 種小漿果香氣成分等等。對于梨香氣的研究主要出現在1995以后，如Suwanagul研究了4種西洋梨的香氣成分，Zlati等[26]研究了Bartlett在不同階段的香氣問題，Chen等[27]研究了鴨梨的香氣，Li G[28]研究了11種東方梨的香氣，Wei S等[29]使用SPME研究了南果梨的香氣變化。

3 梨果實香氣代謝的生化機制

果實香氣來源于果實的次級代謝，次級代謝依賴主代謝正常進行。參與主代謝的化學物質，也即香氣成分的前體物質，由于參與生物代謝反應不同，產生香氣(揮發性)小分子化合物的途徑也不一樣。按照前體物質的類型，可將香氣代謝合成的途徑分為脂肪酸代謝途徑、氨基酸代謝途徑和糖類代謝途徑(單糖)等，其中起決定作用的酶類主要有脂氧合酶(LOX)、醇脫氫酶(ADH)、醇酰基轉移酶(AAT)、β-葡萄糖苷酶(CB)。隨著果實所處的發育階段的不同，相關酶類活性也不同，從而產生不同的果實香氣物質。在不同的階段酶的活性受相關酶基因的調控，如LOX基因家族對果實香氣成分中的酯類的調節，等等。

3.1 脂肪酸代謝途徑

果實香氣的主要成分是酯類、醇和醛類，這些物質的前體物質大多來自脂肪酸的轉化，這一類香氣產生的路徑叫作脂肪酸路徑。在果實香氣合成過程中的脂肪酸路徑有三種類型：α-氧化、β-氧化和脂氧合酶(LOX)途徑，以β-氧化和LOX 途徑為主。LOX 途徑在很多果實的香氣物質代謝中都得到了驗證，如蘋果、甜瓜、桃、梨等[30-33]。LOX 途徑至少有脂氧合酶(LOX)、氫過氧化物裂解酶(HPL)和乙醇脫氫酶(ADH)參與反應，其中脂氧合酶是 LOX 途徑中的第一步反應關鍵酶，決定反應的進行。在反應起始它識別不飽和脂肪酸的“二烯”結構并使其氧化形成過氧羥基脂肪酸，根據其加氧位點不同把LOX酶分成9-LOX和13-LOX兩種類型。LOX基因已從許多植物中分離和鑒定，在果實發育成熟過程中，LOX基因家族差異調節香氣的代謝，如蘋果、梨果實香氣的作用等。脂肪酸代謝途徑如圖1。

圖1 脂肪酸產生香氣的路徑

3.2 氨基酸代謝途徑

果實組織中含有的氨基酸在酶的作用下轉變為揮發性的有支鏈脂肪族醇、醛、酮和短鏈酯類物質[34]，果實香氣的這一來源被稱為氨基酸代謝路徑。氨基酸路徑有兩個支路：一條途徑是在脫羧酶作用下生成醛，然后在醇脫氫酶(ADH)的作用下生成醇，接著參與或者不參與酯的合成；另一條途徑是氨基轉移酶的作用下生成α-酮酸，α-酮酸與輔酶A(CoAs)生成酰基CoAs，然后在醇酰基轉移酶(AAT)作用下生成酯[35]。參與香氣合成的氨基酸主要有纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸和苯丙氨酸等，其中纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和丙氨酸為甲基支鏈酯合成的前體物質。在一些果實中已經得到證實，如草莓、甜瓜、梨，等等[36-38]。氨基酸產生香氣的路徑如圖2。

圖2 氨基酸產生香氣的路徑

3.3 糖類代謝途徑

果實中含有豐富的糖，其中單糖、雙糖和一些糖醇不但是果實風味的來源，同時也是果實香氣的重要前體物質。糖的本質是多羥醛或多羥酮，這些小分子糖經EMP途徑(Embden Meyerhof Parnas pathway)無氧條件下經糖激酶分解成丙酮酸，再在丙酮酸脫氫酶復合體(pyruvate dehydrogenasecomplex)的催化下進行氧化脫羧反應生成乙酰輔酶A。乙酰輔酶A有兩條途徑合成酯：一是在醇轉酯酰酶(AAT)催化下生成乙酸某酯；另一個是在還原酶催化下先生成乙醇，再合成某酸乙酯，具體如圖3所示。

圖3 碳水化合物產生香氣的路徑(單糖)

4 展望

果實香氣是反應果實品質的重要指標。在物質生活日益豐富的今天，人們對品質的追求趨向完美，對消費水果(食品)追求趨向決定了水果產業的發展方向。因而，果實香氣成了近年來研究的熱點。從目前已發表的研究成果來看，果實香氣相關研究主要集中在香氣的種類和品種間果實香氣的差異，果實特征性香氣的確定，主要類別的香氣物質代謝途徑，果實成熟及其貨架期、貯藏期果實香氣成分及相關酶活性的變化等方面，而在如何通過傳統的田間管理等人為手段精準地干預果實主代謝，進而影響次代謝的香氣合成和釋放，以及利用遺傳工程、基因操作技術來改善果實的香氣成分，調控果實香氣的代謝，從而達到提高果實品質等方面研究較少。隨著基因工程技術的快速發展和分子育種等理論的不斷完善，利用分子生物學技術手段，了解果實香氣代謝基因的信息，研究闡明果實香氣代謝的關鍵酶基因的功能，達到對果實香氣代謝的精準調控，是研究果實香氣的必然趨勢。

隨著梨果產業的發展，梨品質提升日益凸顯，特別是在果實香氣方面尤顯突出。本文分析總結國內外梨果實香氣研究的特點，以期給我國梨產業發展中出現的香氣問題提供一定的線索和啟示。