IL-27在重癥肌無力患者血清中的表達及與AChR抗體的相關性分析

馮蘇 潘婧 梁翠娟 趙東蘭

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院2015年1月至2016年12月收治的109例MG患者(MG組)，其中男53例，女56例；平均年齡(48.46±6.32)歲。MG患者按照疾病類型按照以下幾種分組方法：分為眼肌型和全身型；根據CT結果或病理表現分為無胸腺異常、胸腺瘤和胸腺增生；胸腺異常的AChR抗體陽性與陰性組MG患者；發病年齡≤50歲為早發病期的Mg患者和患者發病年齡>50歲為晚發病期的Mg患者[11]。選取115例同期在本院進行健康體檢的表觀健康者作為健康對照組，排除自身免疫性疾病、癌癥和感染性疾病的歷史，其中男54例，女61例；年齡25～50歲，平均年齡(46.20±4.36)歲。2組患者年齡、性別比及病情等比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 入組與排除標準 入組標準(4個標準中的任何2項，但必須包括標準1)：(1)波動性疲乏和疲勞；(2)重復神經刺激試驗；(3)抗膽堿酯酶藥物敏感；(4)抗乙酰膽堿受體結合或阻斷抗體。排除免疫抑制治療史的患者。

1.3 標本采集 早晨空腹時無菌采集肘靜脈血5 ml，用肝素對靜脈血抗凝并搖勻，3 000 r/min低溫離心10 min，分離上層血清置于EP管中于-80℃冰箱中保存，并于測定時恢復室溫通過酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定血清IL-27濃度水平。

1.4 所用試劑及檢測方法 欣博盛 QuantiCyto ELISA試劑盒(試劑批號：H180608-014a)采用雙抗體夾心法：抗人IL-27單抗包被于酶標板上，標本和標準品中的人IL-27會與單抗結合，游離的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-27抗體和辣根過氧化物酶標記的親和素，生物素與親和素特異性結合；抗人IL-27抗體與結合在單抗上的人IL-27結合而形成免疫復合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物，若反應孔中有人IL-27，辣根過氧化物酶會使無色的顯色劑呈現藍色，加終止液變黃。在450 nm處測OD值，人IL-27濃度與OD450值之間呈正比，可通過繪制標準曲線求出標本中人血清IL-27的濃度。

1.5 治療方法 MG患者給予糖皮質激素中等劑量沖擊并小劑量維持治療。開始時予醋酸潑尼松1 mg/kg,口服，1次/d。4～8周后待癥狀緩解后減量至原量的2/3，從每日頓服到隔日清晨頓服，后每2～4周減量 2.5～5.0 mg，直到減至能控制癥狀的最小有效劑量 5～15 mg/d維持，每日或隔日清晨頓服。療程為6個月。

2 結果

2.1 健康對照組和MG組血清中IL-27水平比較 MG組的血清IL-27水平為(282.02±81.03)pg/ml，顯著高于健康對照組(206.91±31.84)pg/ml，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

組別IL-27健康對照組(n=115)206.91±31.84MG組(n=109) 282.02±81.03?

注：與健康對照組比較，*P<0.001

2.2 不同MG患者分組的血清IL-27水平比較 在36例眼肌型和73例全身型MG患者中，血清IL-27濃度水平分別為(228.33±56.26)pg/ml和(307.46±62.79)pg/ml。全身型MG患者的血清IL-27水平顯著高于對照組(P<0.05)。其中77%的MG患者血清中AChR抗體陽性(80/104，5例患者未進行抗體測試)，其血清IL-27濃度水平為(292.35±74.28)pg/ml，血清AChR抗體陰性患者血清IL-27濃度水平為(277.93±80.15)pg/ml，AChR抗體陽性的MG患者與健康對照組的IL-27濃度水平有差異(P<0.05)。當MG患者按年齡分類時，72例早發病和37例晚發病MG患者的血清IL-27水平分別為(392.80±106.56)pg/ml和(217.45±43.84)pg/ml，早發病MG患者的血清IL-27水平顯著高于健康對照組(P<0.001)，而晚發病MG患者的水平與健康對照組無差異(P>0.05)。見表2。

2.3 不同胸腺狀態的MG患者血清IL-27水平 109例MG患者中有20例患有胸腺瘤，12例MG患者同時患有胸腺增生，2組MG患者血清IL-27濃度水平分別為(237.52±29.98)pg/ml和(951.57±237.04)pg/ml，而另外67名沒有胸部CT異常的患者血清IL-27水平為(301.58±53.86)pg/ml。因此，無胸腺異常和胸腺增生患者的IL-27濃度水平均明顯升高，且具有顯著性差異(P<0.001)，但胸腺增生的MG患者血清IL-27濃度水平尤其升高明顯。見表3。

MG患者分組血清IL-27水平眼肌型(n=36)228.33±56.26全身型(n=73)307.46±62.79?AChR抗體(-)(n=24)277.93±80.15AChR抗體(+)(n=80)292.35±74.28?早發病(n=72)392.80±106.56#晚發病(n=37)217.45±43.84

注：與眼肌型和AChR抗體(-)比較，*P<0.05；與晚發病比較，#P<0.01

胸腺狀態血清IL-27水平無胸腺異常(n=67)301.58±53.86?胸腺瘤(n=20)237.52±29.98胸腺增生(n=12)951.57±237.04?

注：與胸腺瘤比較，*P<0.001

2.4 AChR抗體陽性的MG患者AChR抗體水平與血清IL-27濃度的相關性分析 將80例AChR抗體陽性的MG患者血清AChR抗體水平和其血清IL-27濃度水平進行相關性分析。結果發現，AChR抗體陽性的MG患者血清IL-27水平與AChR抗體水平呈正相關，相關系數r=0.792，且差異有統計學意義(P<0.001)。見圖1。

圖1 AChR抗體陽性的MG患者AChR抗體水平;與血清IL-27濃度的相關性分析(r=0.792，P<0.001)

2.5 AChR抗體陽性的MG患者激素治療后血清IL-27降低水平與AChR抗體降低水平相關性分析 將53例AChR抗體陽性的MG患者激素治療后血清AChR抗體降低水平和其血清IL-27濃度降低水平進行相關性分析。結果發現，血清IL-27降低水平與AChR抗體降低水平呈現正相關，相關系數r=0.579，且具有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

3 討論

圖2 激素治療后MG患者AChR抗體降低水平;與血清IL-27濃度降低水平的相關性分析(r=0.579，P<0.05)

此外，本研究亞組分析顯示，廣義MG患者和早發病MG患者的血清IL-27濃度水平也明顯高于對照組(P<0.05)；而晚發病MG患者血清IL-27水平雖較健康對照組稍高，但無統計學意義。以上研究結果可能與機體早期抵抗抗原攻擊時，IL-27高表達并通過胞外信號調節激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2)信號通路促進干擾素λ1(interferon λ1，IFN-λ1)分泌，保護機體抗炎有關[14]。

MG患者中約有10%～15%的患者合并胸腺瘤，80%的患者同時伴有淋巴濾泡增生、胸腺肥大等[15]。調節T細胞介導的免疫調節和免疫細胞的異常募集是負責維持MG患者胸腺中AChR抗體的炎癥和免疫應答的可能機制[16]。胸腺異常的MG患者，源自APC的IL-27誘導T細胞中干擾素-γ(IFN-γ)的產生，IFN-γ反過來對APC發揮作用并上調IL-27表達，導致針對胸腺肌樣細胞的自身反應性T細胞大量增生，誘發胸腺增生或胸腺瘤，該T細胞遷移至靶器官，最終導致MG的發病[17]。Berrih-Aknin等已證明胸腺B細胞在AChR抗體的產生中具有重要作用[18]，由此推斷IL-27可能與MG早發病機制中的胸腺濾泡增生和胸腔內自身抗體的產生有關。本研究中胸腺增生的MG患者血清IL-27濃度水平明顯高于無胸腺異常組和胸腺瘤組，表明IL-27/IFN-γ可能存在永久性的炎癥閉環，導致胸腺濾泡的不斷增生，從而在不同的病理表現階段發揮促炎抗炎和抗腫瘤等作用。

MG發病機制從臨床免疫學角度理解為某些致病因子破壞機體的免疫平衡狀態，重新激活抗原特異性的T細胞，從而輔助體內B細胞執行體液免疫，產生重癥肌無力特異性抗體AChR抗體[19]。諸多證據表明，患者體內的AChR抗體濃度即便很低，AChR抗體陰性，臨床癥狀也可有明顯表現，因此細胞分泌的抗AChR抗體濃度與病情嚴重程度并無關系，而同一病人血漿中抗體水平的變化卻與病情嚴重程度密切相關[20]。本研究結果80例AChR抗體陽性的MG患者體內IL-27濃度水平高于AChR抗體陰性患者，且具有統計學差異(P<0.001)，提示IL-27可能通過調節T細胞介導的體液免疫和誘導B細胞產生的AChR抗體在MG發病中發揮作用。同時本研究數據表明，AChR抗體陽性的MG患者體內IL-27濃度水平與其特異性抗體AChR抗體呈現明顯正相關性(P<0.001)，即隨患者體內IL-27濃度水平增高AChR抗體也有增高趨勢，推斷在MGAChR抗體陽性的患者體內IL-27對其特征性抗體AChR抗體發揮正向調節作用。糖皮質激素治療后患者體內IL-27濃度水平顯著降低，且其降低水平亦和AChR抗體降低水平呈現明顯相關性(P<0.05)。激素治療有效的機制可能是由于糖皮質激素抑制了APC表面的CD86和CD80等共刺激分子的表達以及CD83誘導的TNF-α、IL-6和IL-12等細胞因子的釋放，因此可認為糖皮質激素強烈干擾了APC的分化和成熟，從而導致IL-27的低表達及AChR抗體相應濃度水平的下降[17]。

綜上，研究結果表明IL-27可能在MG免疫調節及發病機制中起重要作用，尤其在具有胸腺增生的AChR抗體陽性早發型MG亞型中更有其重要意義。通過對不同臨床表型的MG患者血清IL-27濃度水平及其與MG特征性抗體AChR抗體的相關性分析，及早抑制IL-27在MG發病機制中的異常免疫反應，從而為MG的臨床診斷和治療提供新的思路。