朱氏潤腸方對慢傳輸型便秘大鼠的作用及其機制研究?

孟 君，陸建良，孫 勇，周 青，嚴士海

(1. 南京中醫藥大學連云港附屬醫院，江蘇 連云港 222001； 2. 江蘇省中醫院，南京 210029)

慢傳輸型便秘(slow transit constipation,STC)是指結腸傳輸功能障礙，腸內容物傳輸緩慢引起的便秘，其癥狀主要表現為大便次數減少、少便意或便意消失、糞質堅硬，一般伴有腹脹，其病因不清，癥狀頑固[1]。由于現代社會節奏加快，人們的精神壓力增大，飲食和生活習慣的改變，使得慢傳輸型便秘的發病率逐年升高，嚴重影響患者的生活質量[2]。目前慢傳輸型便秘還是以西藥治療為主，但是患者需要長期用藥，所以會帶來很多不良反應，如電解質紊亂、胃腸功能障礙以及心血管事件等，而傳統中醫藥治療便秘歷史悠久、療效顯著、不良反應少而輕，但其具體作用機制不明。

朱氏潤腸方是我國首批老中醫藥專家師承指導老師朱秉宜教授的經驗方。他提出“清”“潤”兩法，“以清代通、以潤代瀉”，清熱潤腸，滋陰增液，并研制出朱氏潤腸方。本研究擬復制慢傳輸型便秘大鼠模型，觀察朱氏潤腸方的改善作用，并探討其可能的作用機制，為中醫藥臨床應用提供理論依據。

1 材料

1.1 動物

成年健康雄性Wistar大鼠50只，體質量(220±20) g，由南通大學動物中心提供(合格證號SCXK (蘇)2014-0001)。

1.2 藥物與試劑

大黃和朱氏潤腸方均由連云港市中醫院制劑部提供。朱氏潤腸方組成：玄參、麥冬、生地黃、火麻仁、杏仁、全栝樓、生白術各20 g，升麻15 g，枳殼15 g，由連云港市中醫院制劑部按照2010年版藥典要求制備成水煎劑，約含生藥量2 g/ml。根據文獻[3]計算出中藥人鼠等效劑量為朱氏潤腸方低劑量(28.8 g/kg)，臨床等效劑量的2倍為朱氏潤腸方高劑量(57.6 g/kg)；枸櫞酸莫沙必利片， 成都康弘藥業集團股份有限公司(批號150413)；PI3K、p-PI3K、akt、p-akt抗體、GAPDH一抗(美國 Cell Signaling 公司)；ECL顯色試劑盒、彩色預染蛋白分子量標準(Thermo公司)；PVDF膜(Millipore公司)；DAPI：凱基生物；Anti-AQP3抗體、Anti-AQP8抗體(Abcam公司)。

1.3 實驗儀器

臺式高速冷凍離心機(H1650R)，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；37 ℃恒溫培養箱(DNP-9022)；上海精宏實驗設備有限公司；顯微鏡CX31，日本 OLYMPUS；石蠟包埋機，上海精宏實驗設備有限公司；石蠟超薄切片機 Leica 德國；ABI7500 Real-time PCR定量儀，美國ABI公司；Western SDS-Page 電泳儀，美國BIORAD公司。

2 方法

2.1 大鼠造模與給藥

將50只大鼠按隨機數字表法分為正常組、模型組、朱氏潤腸方高劑量組、朱氏潤腸方低劑量組和莫沙必利組每組各10只。根據文獻[4]采用大黃致瀉結腸法造模，除正常組外其余大鼠按150 mg/kg/d給予大黃懸濁液灌胃，隨后灌胃劑量以150 mg/kg/d遞增，直到50%大鼠出現腹瀉，維持該劑量直到80%的大鼠稀便消失，再以150 mg/kg/d遞增，直到50%大鼠出現腹瀉并維持劑量至80%大鼠便秘，然后再加量，如此循環直到第3次出現80%的大鼠稀便消失，維持該劑量繼續灌胃1周，發現大鼠毛發枯燥，易激怒，糞便量明顯減少，質地偏硬，糞便含水量明顯降低，表明慢傳輸型便秘模型復制成功。造模成功后第1天起給予相應藥物進行干預，朱氏潤腸方高劑量組、低劑量組和莫沙必利組大鼠分別以57.6 g/kg、28.8 g/kg和2.5 mg/kg灌胃給藥，每日1次，連續15 d，正常組和模型組大鼠給予等量生理鹽水。

2.2 測定24 h糞便總量與糞便含水量

收集造模后和治療后各組大鼠24 h糞便總量，記錄顆粒數并稱濕重(A)，將糞便放入干燥箱中干燥3 h，稱干重(B)，計算糞便含水量=(A-B)/A×100%。

2.3 活性炭懸液推進法測定大鼠腸道傳輸功能

在末次給藥后禁食不禁水12 h，分別經口灌入印度墨汁2 ml，30 min后頸椎脫臼法處死，剖腹取出幽門到直腸末端全部腸道，在無張力狀態下測量腸道全長及墨汁在腸道的推進距離，計算墨汁推進距離占腸道全長的百分比并進行結果比較。碳末推進百分率(%)=(碳末推進長度/腸道全長)×100。

2.4 免疫組化法檢測大鼠結腸黏膜AQP3、AQP8表達

取各組大鼠距肛門11 cm處結腸1 cm，用生理鹽水沖洗干凈后放入4%的多聚甲醛中固定。石蠟包埋并切片，脫蠟水化，抗原修復；切片放入3%H2O2溶液阻斷內源性過氧化物酶，5%BSA封閉，每張切片加入50 μL稀釋的一抗覆蓋組織，4 ℃過夜； PBS沖洗加二抗，4 ℃孵育50 min；PBS沖洗加DAB溶液，蘇木素復染，然后50%、70%、80%、90%、100%乙醇浸泡脫水，二甲苯1，2浸泡幾分鐘晾干，滴加中性樹膠封片，干燥后置于顯微鏡觀察。

2.5 熒光定量PCR檢測大鼠AQP3、AQP8 mRNA表達

采用Trizol-離心柱法提取大鼠結腸組織細胞總RNA，測定RNA純度，計算RNA溶液濃度，判斷RNA提取質量：A260/A280>1.8且<2.0，則可以滿足后續RT-qPCR所需。引物由南京拜睿生物科技有限公司合成，引物序列：AQP3：上游5’ CAAGCTGCCCATCTACAC 3’，下游5’ AAAGAAGCCATTGACCATAT 3’，產物長度189 bp；AQP8：上游5’ TCATTGGGTGTCTATCGG 3’，下游5’ AATTAGCAGCATGGTCTTG 3’，產物長度184 bp。內參GAPDH:上游5’AGGTCGGTGTGAACGGATTTG3’，下游5’TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA3’，產物長度126 bp。AQP3、AQP8及GAPDH的PCR參數為：95 ℃預變性30 s，進入PCR循環：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s, 40個循環。采用RT-PCR法檢測大鼠結腸AQP3及AQP8表達，以GAPDH作為內參照，與目的產物進行比較。

2.6 Western Blotting法檢測大鼠結腸PI3K、akt的表達

將各組大鼠結腸組織液氮研磨提取蛋白，采用 BCA 蛋白定量法測定蛋白濃度，電泳后的膠體經過轉膜、封閉等步驟，孵上PI3K、p-PI3K、akt、p-akt、GAPDH一抗，放在冰箱中的搖床上 4 ℃過夜 12 h 后取出，PBS 沖洗 3 次，孵上二抗，常溫下搖 1 h 后將膜取出，放入化學發光凝膠成像系統曝光，采用ImagePro Plus 6.0軟件將掃描后的圖像進行灰度分析。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 對STC大鼠糞便的影響

表1示，采用大黃灌胃之后，各造模組大鼠24 h糞便總量明顯減少，糞便含水量也明顯降低，與正常組比較差異有統計學意義(P<0.01)；經過相應藥物干預之后，各治療組大鼠情況均有所好轉，朱氏潤腸方高、低劑量組和莫沙必利組大鼠24 h糞便總量增加，質地變軟，含水量明顯增加，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。提示朱氏潤腸方能增加STC大鼠的糞便總量與含水量，改善便秘癥狀。

3.2 對STC大鼠腸道傳輸功能的影響

表2示，與正常組比較，STC造模組大鼠碳末推進率明顯降低(P<0.01)，而各治療組大鼠的碳末推進率均明顯提高，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)，提示朱氏潤腸方能增強STC大鼠腸道傳輸功能。

表2 朱氏潤腸方對STC大鼠腸道傳輸功能的影響

3.3 對大鼠結腸黏膜AQP3、AQP8表達的影響

圖1示，AQP3和AQP8陽性細胞均為棕黃色，與正常組比較，STC造模組大鼠結腸黏膜AQP3和AQP8陽性細胞比例明顯增高，差異有統計學意義(P<0.01)；經過相應藥物干預，各治療組大鼠黏膜呈淺棕黃色表達，朱氏潤腸方高、低劑量組均能明顯減少AQP3和AQP8陽性細胞的數量，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。提示朱氏潤腸方能降低STC大鼠AQP3和AQP8的表達，治療便秘。

3.4 對大鼠結腸AQP3、AQP8 mRNA表達的影響

圖1 朱氏潤腸方對大鼠結腸黏膜AQP3、AQP8表達的影響(免疫組化，×400)

表3示，與正常組比較，STC造模組大鼠結腸AQP3和AQP8 mRNA的表達明顯升高(P<0.01)；而經過相應藥物干預之后，各治療組大鼠AQP3和AQP8 mRNA的表達明顯降低，朱氏潤腸方高劑量組降低尤其明顯，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)，與免疫組化的結果類似。提示AQP3和AQP8表達升高可能是導致慢傳輸型便秘的病理機制之一，而朱氏潤腸方可能通過降低AQP3和AQP8的表達來改善慢傳輸型便秘。

3.4 對大鼠結腸PI3K、akt表達的影響

圖2表4示，Western Blot結果顯示，各組大鼠結腸PI3K、akt的表達差異不大(P>0.05)。與正常組比較，模型組大鼠結腸p-PI3K、p-akt的表達明顯升高(P<0.01)；而經過相應藥物干預之后，各治療組大鼠p-PI3K、p-akt的表達明顯降低，朱氏潤腸方高劑量組降低最明顯，差異有統計學意義(P<0.01)。提示PI3K/akt信號通路激活可能在慢傳輸型便秘的發生發展中起重要作用，而朱氏潤腸方通過抑制該通路的磷酸化來改善慢傳輸型便秘。

表3 朱氏潤腸方對大鼠結腸AQP3、AQP8 mRNA表達的影響

注：圖中1-5分別代表正常組、模型組、朱氏潤腸方高劑量組、朱氏潤腸方低劑量組與莫沙必利組圖2 朱氏潤腸方對大鼠結腸PI3K/akt表達的影響

4 討論

慢傳輸型便秘是一種臨床常見疾病，尤其是中老年人居多，患者主要表現為大便秘結、排便次數減少、腹脹等，還會引起一些心理疾病，嚴重影響患者的生活質量。但是，目前慢傳輸型便秘的病因及發病機制尚不完全明確。中醫認為慢傳輸型便秘病變部位主要在大腸，其病機主要表現為氣虛、陰虛兩方面[5]，導致腸道干澀不潤、腑氣滯留不下。朱氏潤腸方是朱秉宜的經驗方，該方健脾益腎補其氣血，增液潤腸，行氣導滯[6]，從而療效顯著，得到患者的肯定，但其作用機制尚不明確。因此，本研究旨在觀察其療效，探討其機制。

本實驗采用大黃灌胃復制慢傳輸型便秘模型，觀察大鼠的一般體征，如毛發枯燥，活動減少，飲食量減少，大便量少而干燥，與臨床STC患者癥狀類似。采用活性炭懸液推進法測定大鼠的腸道傳輸功能，發現腸道碳末推進率明顯降低。經過相應藥物干預之后，證實朱氏潤腸方可以增加大鼠的糞便總量和糞便含水量，提高大鼠腸道碳末推進率，改善慢傳輸型便秘癥狀。

表4 朱氏潤腸方對大鼠結腸PI3K/akt表達的影響

隨著近年來病理生理學以及分子生物學的快速發展，慢傳輸型便秘已被證實與腸道水通道蛋白(AQPs)密切相關。AQPs屬通道蛋白MIP家族成員，是一種位于細胞膜上的蛋白質(內在膜蛋白)，在細胞膜上組成“孔道”，通過調整生物膜的透水性，介導水由低滲區向高滲區移動，參與水的分泌、吸收等，廣泛分布于消化道，在消化道水分的轉運中起重要作用。而AQPs在結腸的異常表達，使得結腸中水的重吸收過多，分泌過少，可能是導致慢傳輸型便秘的主要原因之一[7]。眾多國內外文獻認為，與便秘相關的主要是AQP3和AQP8。

AQP3和AQP8分布于腸上皮細胞內，可吸收腸腔內水分，改變腸腔的內分泌環境。研究表明，便秘患者結腸中AQP3表達升高，使得結腸中水分重吸收增多，大便干燥，傳輸速度減慢，時間延長[8-9]。AQP8在結腸水分轉運過程中也起了重要作用，在腹瀉患者結腸中表達降低，在便秘患者結腸中表達明顯升高[10-11]。目前在臨床上，朱氏潤腸方對便秘療效顯著，停藥后未見明顯反彈。在解除便秘的同時，調整了紊亂的胃腸功能，并使患者的體質狀況得到改善，是否與水通道蛋白調節腸道水液代謝有關？本實驗中通過免疫組化法和RT-PCR法檢測發現，STC大鼠結腸AQP3和AQP8的表達明顯升高，而朱氏潤腸方可以降低AQP3和AQP8的表達。實驗結果表明，朱氏潤腸方可以通過降低AQP3和AQP8的表達改善STC癥狀。

朱氏潤腸方如何可以降低AQP3和AQP8的表達？本文進一步實驗欲探索可能的作用機制。眾多研究證實，PI3K(磷脂酰肌醇3激酶) /akt(蛋白激酶B)信號傳導通路在細胞增殖、分化、凋亡、炎癥、氧化應激等方面起到了重要作用。李旻昊[12]和孫路強[13]等證實，PI3K /akt通路在慢傳輸型便秘中也起關鍵作用，當便秘發生時PI3K和akt的表達明顯增加。國內外眾多研究表明，發生慢傳輸型便秘后，機體釋放出神經細胞生長因子等激活具有酪氨酸激酶活性的受體，隨即特異性地結合PI3K調節亞基，激活后的PI3K可以使細胞膜上的肌醇發生磷酸化生成第二信使，結合其下游的效應分子akt，使akt的Thr308位點以及Ser473位點發生磷酸化，由抑制狀態變為激活狀態成為p-akt[14]。p-akt作用于下游水通道蛋白AQP3和AQP8，增加腸道對水的重吸收，使大便干燥造成便秘[15]。本實驗結果發現，慢傳輸型便秘大鼠腸道磷酸化的PI3K和akt表達明顯增多，下游水通道蛋白AQP3和AQP8的表達也明顯升高，與文獻報道一致。經朱氏潤腸方干預之后，PI3K/akt的磷酸化水平降低，水通道蛋白AQP3和AQP8表達也降低，便秘癥狀得到改善。

綜上所述，朱氏潤腸方對慢傳輸型便秘具有明顯的改善作用，其機制可能是通過抑制PI3K/akt信號通路，從而降低AQP3和AQP8的表達，減少腸道對水的重吸收，增加腸液的分泌，改善腸腔的內分泌環境。本研究為傳統經驗方的發展提供了理論和實驗依據，深入的分子機制研究與靶點治療將是下一步的研究重點。