中醫綜合外治法對肛瘺術后模型大鼠創面愈合指標的影響?

刁翰林，徐 麗，程文秀，郁 悅，陳思儒，丁 楠，師 偉

(1. 山東中醫藥大學，濟南 250014； 2. 山東大學附屬省立醫院，濟南 250021； 3. 東中醫藥大學附屬醫院，濟南 250014)

肛瘺(anal fistula，AF)近年發病率持續增高約4倍[1]，手術是其常規治療手段。但是由于AF位置特殊，手術后創面愈合緩慢與疼痛成為臨床常見問題。課題組前期研究證明，以中藥外洗、電針刺激和耳穴壓豆為主的中醫綜合外治法，可明顯加快AF術后患者創面的愈合速度，促進VEGF、bFGF表達，提高患者血清P物質(substance p，SP)含量[2]。而速激肽1型受體(NKIR)是目前公認SP最敏感的受體。有研究表明，上調SP/NK1R可減少炎癥反應[3]，促進VEGF與FGF-2釋放[4-5]，加速血管修復與生成，對創面愈合起到促進作用。基于前期工作，本實驗就中醫綜合外治法促進AF術后創面愈合的可能機制展開實驗探索，以為臨床提供新的思路與手段。

1 材料與方法

1.1 分組、造模及干預方法

1.1.1 動物與分組 選取12周齡、體質量(220±20)g的SD雄性大鼠共30只(動物批準號37009200007764)，按隨機數字表法分為中醫綜合外治組(治療組)、口服曲馬多組(對照組)和模型組(空白組)，并分別編號、稱重，每日自由進食、飲水。

1.1.2 飼養及造模方法 適應性喂養1周后，按照何永恒[6]等造模方法，將大鼠麻醉并待肛門松弛后，以肛緣為界，切開皮膚至直腸黏膜，創面修剪為三角形缺損(底寬1 cm，高2 cm)，損傷深度達肛門括約肌。

1.1.3 干預措施 圖1示，各組大鼠俯臥位固定，以醫用棉簽蘸取碘伏溶液，反復擦拭創面5次至局部滲血，造成大鼠肛周創面的模擬臨床換藥刺激，每日1次。其中對照組于換藥刺激前1 h給予3.25%鹽酸曲馬多溶液2 ml灌胃；治療組于換藥刺激前5 min給予免煎中藥湯劑活血止痛散外洗，以完全浸透藥液的2×2×2 cm醫用棉球，控制藥液溫度45 ℃，將棉球緊敷于大鼠肛門創面并以多層厚紗布固定約5 min。根據《實驗針灸學》[7-8]等文獻定穴原則，選定大鼠長強穴、次髎穴，于換藥刺激時使用韓氏穴位神經刺激儀將針灸毫針刺入穴位，給予經皮穴位電刺激操作，頻率2 Hz，起始強度1 mA，持續5 min。后根據《實驗針灸學》耳穴定位原則，以人耳穴定位類比大鼠耳穴定位，取肛門穴、直腸穴、交感穴，用棉簽棒按壓模擬耳穴壓豆刺激；空白組不給予干預措施。

圖1 耳穴位置示意圖

1.2 實驗器材及試劑

1.2.1 實驗藥物及手術器械 活血止痛散(魯藥制字Z2012003195)，按照同等劑量轉換為規范中藥免煎顆粒劑型(江陰天江藥業有限公司)。藥物組成：乳香15 g，沒藥15 g，赤芍20 g，制大黃30 g，五倍子15 g，白芷15 g，馬齒莧30 g，元胡15 g，蒲公英30 g。鹽酸曲馬多片、碘伏等由山東大學省立醫院中心實驗室動物房提供。手術器械(組織剪、眼科剪、組織鑷)、無菌棉球、生理鹽水、福爾馬林、麻醉藥品等，由山東大學省立醫院中心實驗室動物房提供。

1.2.2 試劑與試劑盒 Western Blot相關試劑：蛋白質提取試劑盒、SDS-PAGE濃縮膠試劑盒、顯影液及定影液購自碧云天生物技術有限公司；蛋白質濃度測定試劑盒購自索萊寶生物科技有限公司，血管內皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(bFGF)抗體購自Affinity公司；其余試劑均由山東大學省立醫院中心實驗室提供。ELIDA相關試劑：白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF-α)試劑盒均購自武漢基因美生物科技有限公司。PCR相關試劑：成纖維細胞生長因子(bFGF)、神經肽P物質mRNA(SPmRNA)、NK1RmRNA引物購自上海博尚生物科技有限公司(引物序列見表1)，總RNA提取試劑盒購自天根生物科技有限公司，逆轉錄試劑盒、快速定量PCR試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒購自東洋紡生物科技有限公司。

表1 引物名稱序列

1.3 取材及保存

造模后常規飼養10 d，麻醉后固定大鼠，將大鼠腹中部皮膚去毛常規消毒、鋪巾，心臟灌流處死，取大鼠創面組織立即置于液氮中暫存，于-80 ℃中長期保存。另取部分創面組織立即投入Trizol中，嚴格按照總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，并將提取液及組織置于-80 ℃中保存。

1.4 檢測指標及步驟

1.4.1 Western Blot法檢測創面組織VEGF、bFGF及操作步驟 將創面組織置于勻漿器中于冰上研磨，嚴格按照說明書操作步驟進行蛋白質提取與濃度測定，加25%體積5×loading buffer后金屬浴變性10 min，配置濃度10%的濃縮膠，按照30 V 60 min、80 V 90 min進行電泳，100 V 40 min進行轉膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST洗膜3次10 min，一抗4 ℃搖床孵育過夜；第2天取出，TBST洗膜3次10 min，二抗室溫搖床孵育1 h，TBST洗膜3次10 min，于暗室顯影。

1.4.2 ELIDA法檢測創面組織IL-1、IL-6、TNF-α及操作步驟 取組織勻漿，嚴格按照說明書操作，將標準品按照說明書操作方法梯度稀釋后，另取待測樣品孔加樣10 μl并設空白孔，后于每孔加入酶標試劑 50 μl(空白孔除外)，封板膜封板并置37 ℃恒溫箱溫育 30 min，每孔加滿洗滌液靜置 30 s棄去，重復洗滌 5 次拍干，先后加入顯色劑A、B各50 μl，37 ℃避光顯色10 min，加終止液 50 μl，以空白孔調零，450 nm 波長依序測量各孔的吸光度，將結果帶入回歸曲線進行濃度計算。

1.4.3 PCR法檢測bFGFmRNA、SPmRNA、NK1RmRNA及操作步驟 取100 mg左右組織加入裂解液RZ 1 ml，嚴格按試劑說明書操作步驟進行總RNA提取，并檢測樣本RNA的純度與濃度；設置反應體系10 μL置于eppendorf儀，以37 ℃ 15 min、98 ℃ 5 min、70 ℃ 10 min進行逆轉錄，離心3 min后按照95 ℃ 1 s高溫預變性，按95 ℃ 5 s、58 ℃ 10 s、72 ℃ 15 s，循環45次進行RNA擴增，上機進行mRNA定量分析。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠創面愈合情況

圖2～4示，各組干預治療10 d后觀察創面愈合情況。淺色橢圓內為造模位置即創面位置。實驗組與對照組創面均紅潤，有新鮮肉芽組織生長，其中實驗組創面干燥，愈合良好，無炎性滲出物；對照組創面較干燥、愈合較好，可見極少量炎性滲出物，治療效果較實驗組稍差；空白組創面濕潤，可見肉芽水腫，有較多炎性滲出物(如深色橢圓所示位置)，愈合較差。

圖2 實驗組創面

圖3 對照組創面

圖4 空白組創面

圖5 Western Blot條帶

2.2 Western Blot法結果

圖5表2示,在bFGF方面與空白組比較，對照組與治療組bFGF含量均升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與對照組比較，治療組bFGF升高，差異無統計學意義(P>0.05)。在VEGF方面，對照組與空白組比較，VEGF含量均升高，差異有統計學意義(P<0.05)；治療組與空白組和對照組比較，VEGF含量均升高，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3 ELIDA法結果

表3示，在IL-1與IL-6方面，對照組與空白組、治療組與空白組、治療組與對照組比較，IL-1與IL-6含量降低，差異有統計學意義(P<0.05)。在TNF-α方面，對照組與空白組、治療組與空白組比較，TNF-α含量均降低，差異有統計學意義(P<0.01)；治療組與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 bFGF、VEGF相對灰度值比較

表3 ELIDA法檢測IL-1、IL-6、TNF-α 結果比較

2.4 PCR法結果

表4示，在bFGFmRNA方面與空白組比較，對照組與治療組bFGFmRNA含量均升高，差異有統計學意義(P<0.01)；治療組與對照組比較，bFGFmRNA升高，差異無統計學意義(P>0.05)，結果與Western Blot一致。在SPmRNA方面，對照組與空白組比較、治療組與空白組比較、治療組與對照組比較，SPmRNA含量均升高，差異有統計學意義(P<0.01)；在NK1RmRNA方面，對照組與空白組比較、治療組與空白組比較、治療組與對照組比較，NK1RmRNA含量均升高，差異有統計學意義(P<0.01)。

表4 PCR法檢測bFGFmRNA、SPmRNA、NK1RmRNA結果比較

3 討論

肛瘺術后屬于中醫學“金刃所傷”范疇，“脈絡崩斷”是其直接病機，基本治法為化瘀通絡、理氣止痛、收斂生肌[9]。現在大量文獻報道，中藥內服、中藥熏洗、針灸與耳穴壓豆可有效促進患者術后創面愈合[10]。本實驗所采用的外洗方劑活血止痛散，方中乳香、沒藥、五倍子可行氣止痛、消腫生肌，配伍元胡、馬齒莧可加強止痛作用，赤芍、大黃、白芷與蒲公英清熱涼血兼具解毒消腫，全方具有活血解毒、化瘀通絡的功效。針刺長強穴與次髎穴可清熱通便，活血化瘀，配合活血止痛散外洗，可以增強去腐生肌、活血止痛的作用。肛門穴、直腸穴和交感穴是肛瘺術后耳穴壓豆的常用穴[11]，與湯藥外洗、電針刺激相輔相成，三法并用加強止痛促愈效果。課題組前期證實[2]，活血止痛散湯劑外洗、電針刺激與耳穴壓豆等中醫綜合外治法可明顯提高AF術后患者創面愈合速度，降低創面肉芽組織生長的形態異常率。

研究表明，VEGF高表達，特異性結合血管內皮細胞膜上的受體酪氨酸激酶，從而激活其下游的相關基因表達，刺激血管內皮細胞分裂、增殖及遷移，誘導間質膠原酶的表達[12]，最終形成新生血管，對全身各組織血管的生長、增殖與遷移有顯著效果[14]，促進肉芽組織及其血管內皮細胞與毛細血管的生長促進創面愈合[15]；bFGF可特異結合其具有酪氨酸激酶活性的受體激活PI3K/Akt通路[15-16]，使活化的Akt轉移至胞內進一步活化下游靶點，從而促進細胞生長、增殖[17]，并與VEGF在創面愈合協同作用，加強止血與血管生成，共同促進創面愈合[18]。IL-1、IL-6和TNF -α作為炎癥因子，可以加速炎癥介質的釋放，引起組織損傷，并與創傷程度成正相關[19]，可在一定程度上反映創面愈合速度。有實驗證明，SP可以促進血管生成與創面愈合，降低炎癥因子的表達[20-21]，應用NK1R拮抗劑又可延遲傷口愈合速度，加重炎癥反應[22]，故而推測上調SP/NK1R通路加速血管生成參與創面愈合，可能與促進VEGF、bFGF及降低炎癥因子釋放有關。SP作為一種神經遞質，可在中樞神經系統發揮止痛作用，于中腦PAG區促進內啡肽釋放，同時SP在周圍神經系統又可傳遞痛覺信息[23-24]；SP/NK1R高表達又可激活中腦導水管周圍灰質的下行抑制系統[25]，通過調節5-羥色胺表達[26],平衡自感覺神經傳入的傷害性疼痛電信號[27]，減弱痛覺自下而上的傳遞，在促進創面愈合因子釋放的同時，抑制痛覺中樞興奮，從而發揮止痛與促愈的雙重效果。

炎性浸潤是創面修復過程的啟動環節，新血管生成是肉芽組織形成的重要標志，二者均可反映創面愈合情況。在本實驗中，治療組與對照組的bFGF與VEGF均升高，IL-1、IL-6與TNF-α均降低，提示中醫綜合外治法可促進創面肉芽組織的血管平滑肌細胞生長與毛細血管生成，并降低炎癥反應，提高創面愈合速度，總體上中醫綜合外治法效果更好。同時本實驗還發現，該2組大鼠SPmRNA與NK1RmRNA含量均升高，結合前文所述，提示中醫綜合外治法可通過上調SP/NK1R通路來參與肛瘺術后創面促愈過程。

綜上所述，湯劑外洗、電針刺激和耳穴壓豆刺激的中醫綜合治法可提高肛瘺術后模型大鼠的創面愈合速度，并可通過上調SP/NK1R關鍵通路來促進bFGF與VEGF表達，抑制IL-1、IL-6與TNF-α等炎癥因子的表達，促進局部血管生成，降低炎癥反應，從而實現促進創面愈合的作用。在減少抗生素使用、降低醫院藥物占比與促進肛瘺術后患者創面愈合方面，本實驗可提供新的手段與思路。