燈盞花素對H9c2心肌細胞增殖凋亡及其對ERK1/2信號通路活化的影響

袁鷹 何平 湯祥瑞 李炯俠 牟建軍

1西安交通大學醫學院附屬三二〇一醫院心血管內科（陜西漢中723000）；2西安交通大學第一附屬醫院（西安710061）

心臟疾病具有高致殘率和高死亡率的特點，嚴重威脅我國居民的健康，從分子水平探討心肌細胞的增殖和凋亡可以為心臟治療提供理論依據［1-2］。燈盞花素（Bregenin，Bre）是從燈盞花植物中分離提取的黃酮類化合物，又稱野黃芩苷（scutellarin，SCU），具有抗炎、抗凝、抗氧化、減少平滑肌細胞的遷移與增殖等作用［3］。臨床多用于治療心絞痛、冠心病及急性心肌梗死［4］。有研究結果表明，燈盞花素可能通過抑制氧化應激反應，進而減輕心肌細胞I/R 損傷，起到心肌保護作用［5］。燈盞花素作為一種非競爭性蛋白激酶C（PKC）抑制劑，可通過改善不同性質的心臟損傷，抑制心肌細胞的凋亡，發揮保護心肌的作用［6］，但具體機制尚不明確。細胞外信號調節蛋白激酶（extracellular signal-regulatedprotein kinases，ERK1/2）通路廣泛參與調控心肌細胞的生長、分化與凋亡［7］，燈盞花素對缺氧心肌的保護作用是否與此有關，未見相關報道。因此本實驗觀察燈盞花素對缺氧H9c2心肌細胞增殖與凋亡的影響，并探討其可能機制，以期為燈盞花素的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株H9c2 心肌細胞，中國科學院上海細胞研究院。

1.2 藥品與試劑燈盞花素，規格：20 mg，購自中國藥品生物制品檢定所；胎牛血清（FBS）購自美國Hyclone-PIERCE 生物技術有限公司；胰蛋白酶、二甲亞砜（DMSO）、DMEM 培養基購自上海生物工程有限公司；MTT、ERK1/2 抑制劑PD98059 購自武漢普諾賽生命科技有限公司；鼠單克隆抗體ERK、兔抗鼠p-ERK 抗體、β-actin 抗體購自美國圣克魯斯生物技術有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒購自美國Gibco 公司生產；Annexinv-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒購自美國Epitmics 公司。

1.3 儀器IX73 倒置熒光顯微鏡，德國Eppendorf儀器有限公司生產；BD accuri C6 流式細胞儀，美國BIO-RAD 公司生產；聚丙烯酰胺垂直電泳、Labwork 凝膠圖像分析系統、Labwork 凝膠圖像分析系統，日本奧林巴斯光學有限公司生產；ELX-808 酶標儀，美國伯樂公司生產。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養使用含10%FBS 的DMEM 的培養基、鏈霉素（100 μg/mL）和青霉素（100 μg/mL）的細胞培養液培養H9c2 心肌細胞，在37 ℃，飽和濕度，含有5% CO2的培養箱恒溫培養。每2～3 d培養液更換1 次。當H9c2 心肌細胞生長到對數期時，以8×104接種到96 孔培養板上，進行分組處理培養。

1.4.2 細胞凋亡模型的建立及實驗分組恒溫培養24 h 后的H9c2 心肌細胞分對照組及實驗組（模型組、Bre 低中高劑量組、空白ERK1/2 抑制劑組及Bre 聯合ERK1/2 抑制劑組），實驗組均采用終濃度為200 μmol/L 的H2O2作用6 h 建立心肌細胞缺氧模型。

對照組：使用10%的FBS 和DMSO 處理。隨后各實驗組分別做以下處理：模型組（H2O2）：加入終濃度為200 μmol/L 的H2O2；Bre 低劑量組（Bre 20）組：同時加入終濃度為20 μmol/L 的Bre 和200 μmol/L 的H2O2；Bre 中劑量組（Bre 40）組：同時加入終濃度為40 μmol/L 的Bre 和200 μmol/L 的H2O2；Bre 高劑量組（Bre 80 組：同時加入終濃度為80 μmol/L的Bre和200 μmol/L 的H2O2；空白ERK1/2抑制劑組（PD98059）組：終濃度為50 μmol/L 的PD98059 預處理30 min，再加入終濃度為200 μmol/L 的H2O2；Bre 聯合ERK1/2 抑制劑組（Bre 80+PD98059）組：終濃度為50 μmol/L 的PD98059 預處理30 min，同時加入終濃度為80 μmol/L 的Bre和200 μmol/L 的H2O2。

1.4.3 MTT 法檢測細胞的增殖率取以上不同分組處理培養48 h 后的H9c2 心肌細胞，參考文獻［8］分別加入MTT 溶液20 μL（5 mg/mL），放入恒溫培養箱培養4 h，棄去上清液，使用PBS 緩沖液洗滌2～3 次，每孔加入150 μL DMSO，室溫下，在恒溫搖床上緩慢震蕩10 min 使結晶物充分溶解，使用酶聯免疫檢測儀在490 nm 波長處檢測各組各孔的吸光度（OD值），每組取5 個平行樣。細胞增殖率=OD實驗孔/OD對照孔×100%。

1.4.4 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測細胞的凋亡率消化、收集以上不同分組處理培養48 h 后的H9c2 心肌細胞，參考文獻［5］加入AnnexinV-FITC混勻后，再加入1～2 滴PI 染液，充分混勻后，立即采用流式細胞儀檢測各組心肌細胞DNA 含量，即熒光強度值，采用MultiCycle 軟件進行分析計算細胞的凋亡率。

1.4.5 Western blot 法檢測ERK1/2 信號通路的磷酸化水平收集以上不同分組處理培養48 h 后的H9c2 心肌細胞，使用4 ℃預冷細胞裂解液（RIPA：PMSF=94∶6）100 μL 于冰上裂解30 min，細胞裂解液在4 ℃下12 000 r/min 離心8 min，取上清，使用BCA 蛋白試劑盒對上清液進行蛋白定量，在提取的蛋白質中加入5×SDS 凝膠上樣緩沖液混勻，在沸水中煮8 min，使用SDS-PAGE 電泳對目的蛋白進行分離，濕轉到硝酸纖維（PVDF）膜，5%的脫脂牛奶封閉液封閉2 h 后，加入鼠抗β-tubulin（1∶500）、鼠抗ERK1/2（1：500）、兔抗p-ERK1/2（1∶500）等一抗4 ℃孵育過夜，PBS 清洗3 次，每次5 min，然后分別加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（1∶1 500），37 ℃孵育1 h，再使用PBS 洗膜3 次，每次10 min，用超敏ECL 化學發光顯影法進行曝光顯影，使用AlphaImager 2200 凝膠圖像分析系統分析膠片的光密度值。灰度比值=蛋白條帶灰度/內參照蛋白條帶灰度。

1.5 統計學方法所有實驗數據均采用SPSS 21.0 統計軟件分析處理，計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素ANOVA 分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 燈盞花素對H9c2 心肌細胞增殖的影響與Control 組相比，經H2O2處理后的心肌細胞的增殖率降低，且差異有統計學意義（P＜0.01），但經過在20～80 μmol/L Bre 各濃度組的干預后，明顯促進了H9c2 心肌細胞的增殖，且隨著濃度的增加H9c2 心肌細胞的增殖率升高（P＜0.01）。與H2O2組比較，加入ERK1/2 抑制劑PD98059 的各組細胞增殖率差異無統計學意義（P＞0.05）。與Bre 各劑量組相比，加入ERK1/2 抑制劑PD98059 的H9c2 心肌細胞的增殖率顯著下降（P＜0.01）。與Bre 80+PD98059 比較，PD98059 組中的心肌細胞的增殖率差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 燈盞花素對H9c2 心肌細胞凋亡的影響與Control 組相比，經H2O2處理后的心肌細胞的凋亡率升高，且差異有統計學意義（P＜0.01），經過在20～80 μmol/L Bre 各濃度組干預后的H9c2 心肌細胞的凋亡率隨著濃度的增加降低（P＜0.01）。與H2O2組比較，加入ERK1/2 抑制劑PD98059 的各組心肌細胞的凋亡率差異無統計學意義（P＞0.05）。與Bre 各劑量組比較，加入ERK1/2 抑制劑PD98059 的各組細胞的凋亡率顯著上升（P＜0.01）。但PD98059 與Bre 80+PD98059 組之間的心肌細胞的凋亡率差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表1 各實驗組對H9c2 心肌細胞增殖率的影響Tab 1 Effect of each experimental group on the proliferation rate of H9c2 cardiomyocytes ±s

表1 各實驗組對H9c2 心肌細胞增殖率的影響Tab 1 Effect of each experimental group on the proliferation rate of H9c2 cardiomyocytes ±s

注：與對照組比較，**P＜0.01；與H2O2模型組比較，##P＜0.01；與Bre 20 組比較，ΔΔP＜0.01；與Bre 40 組比較，▲▲P＜0.01；Bre 80組比較，※P＜0.01

分組對照組H2O2模型組Bre 20 Bre 40 Bre 80 Bre 80+PD98059 PD98059例數6 6 6 6 6 6 6增殖率(%)99.87±0.22 65.37±4.52**73.76±6.23**##81.25±5.16**##ΔΔ 92.52±6.63**##ΔΔ▲▲67.09±3.81**ΔΔ▲▲※※66.82±4.33**ΔΔ▲▲※※

表2 各實驗組對H9c2 心肌細胞凋亡率的影響Tab.2 Effect of each experimental group on the apoptosis rate of H9c2 cardiomyocytes ±s

表2 各實驗組對H9c2 心肌細胞凋亡率的影響Tab.2 Effect of each experimental group on the apoptosis rate of H9c2 cardiomyocytes ±s

注：與對照組比較，**P＜0.01；與H2O2模型組比較，##P＜0.01；與Bre 20 組比較，ΔΔP＜0.01；與Bre 40 組比較，▲▲P＜0.01；Bre 80組比較，※P＜0.01

分組對照組H2O2模型組Bre 20 Bre 40 Bre 80 Bre 80+PD98059 PD98059例數6 6 6 6 6 6 6凋亡率（%）6.26±0.17 72.57±2.12**59.36±2.85**##51.29±2.03**##ΔΔ 30.71±1.39**##ΔΔ▲▲71.22±3.63**##ΔΔ▲▲※※70.56±2.91**ΔΔ▲▲※※

2.3 燈盞花素對H9c2 心肌細胞中ERK1/2 信號通路的磷酸化水平的影響從實驗結果看，與Control 組相比，其他各組的p-ERK1/2 蛋白表達均顯著增加（P＜0.05 或P＜0.01）；與H2O2組比較，Bre 各濃度組中p-ERK1/2 蛋白表達量均顯著增加（P＜0.01），且隨著濃度的增加p-ERK1/2 蛋白表達量上升（P＜0.01）。與Bre 各濃度組比較，經過ERK1/2抑制劑PD98059 處理后的Bre 80+PD98059、PD98059 兩組細胞中，p-ERK1/2 蛋白的表達被顯著抑制（P＜0.01）。各組間ERK1/2 蛋白表達量差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1-3。

圖1 Western blot 檢測H9c2 心肌細胞ERK1/2 信號通路相關蛋白的表達Fig.1 Western blot analysis of ERK1/2 signaling pathwayrelated protein expression in H9c2 cardiomyocytes

圖2 各實驗組ERK1/2 蛋白的相對表達量Fig.2 Relative expression levels of ERK1/2 protein in each experimental group

圖3 各實驗組p-ERK1/2 蛋白的相對表達量Fig.3 Relative expression levels of p-ERK1/2 protein in each experimental group

3 討論

心血管疾病是一種嚴重威脅50 歲以上中老年人健康的常見病，約50%的心血管患者生活不能完全自理，我國每年死于心血管疾病的人數高達300 萬人，居各種死因首位［9-10］。心肌細胞的凋亡在各種心臟疾病的發生與發展中起著重要作用［11］。目前，關于心肌細胞凋亡和增殖的分子機制是當前臨床研究的熱點。

燈盞花素屬于黃酮類化合物，可通過抑制凋亡發揮對不同類型的心腦損傷的保護作用［12-13］。研究顯示，燈盞花素可通過調節PI3K/Akt/eNOS 信號通路及抑制氧化應激反應，有效抑制缺血再灌注大鼠誘導的心肌細胞凋亡［14］。但燈盞花素是否能有效改善缺氧環境下的心肌細胞凋亡，未見相關報道。本研究表明，燈盞花素顯著提高了缺氧H9c2 心肌細胞的增殖率，并顯著降低了缺氧心肌細胞的凋亡率，且呈現明顯的濃度依賴性，結果提示，燈盞花素能有效促進在缺氧環境中心肌細胞的增殖，緩解因缺氧誘導的心肌細胞凋亡。

促有絲分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activatedprotein kinases，MAPK）是細胞內的一組絲/蘇氨酸蛋白激酶家族，能將細胞信號傳遞到細胞核，具有促進凋亡與促進增殖的雙重調控作用［15-16］。ERK1/2 是MAPK 家族中的重要亞族之一，在細胞的生長、分化和增殖等多種病理生理過程中起著重要的調控作用［17-18］。研究顯示，姜黃素煙酸酯可能通過下調p-ERK1/2、CyclinD1 蛋白的表達而明顯抑制血管平滑肌細胞增殖［19］；瓜蔞皮提取物可通過激活ERK1/2 和PI3K/Akt 轉導通路，阻止由H2O2誘導的H9c2 細胞損傷而起到保護作用［20］。在本研究中，燈盞花素顯著上調了H9c2 缺氧心肌細胞中p-ERK1/2 的表達，并呈現濃度依賴性，同時經過ERK1/2 抑制劑PD98059 的干預后，其H9c2 缺氧心肌細胞存活率明顯降低，凋亡率顯著升高，并且p-ERK1/2 蛋白的表達量顯著降低。結果提示，燈盞花素可激活H9c2 缺氧心肌細胞中ERK1/2 信號通路相關蛋白的表達。

綜上所述，燈盞花素可增加H9c2 缺氧心肌細胞的增殖，并降低H9c2 缺氧細胞的凋亡，其機制可能與活化ERK1/2 信號通路有關。