納米羥基磷灰石通過溶酶體-線粒體通路誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的凋亡機(jī)制

董文敬 張海松 徐玉曉 崔靜 陳玉杰 王倩 葛坤 高燕 董文英

1河北大學(xué)附屬醫(yī)院（河北保定071000）；2保定市第一中心醫(yī)院（河北保定071000）；3河北大學(xué)（河北保定071000）；4吉林大學(xué)（吉林吉林132000）

羥基磷灰石（HAP）是骨骼和牙齒中最重要的無機(jī)礦物成分，但并非所有的HAP 都對(duì)人體有益。在泌尿系統(tǒng)，由HAP 誘導(dǎo)形成的Randall 斑塊是促進(jìn)腎結(jié)石形成的重要原因［1］。在Randall 斑塊中存在從大小由納米到微米及不同形態(tài)的HAP［2］。草酸鈣結(jié)石是一種最常見的腎結(jié)石，其形成機(jī)制尚未完全闡明［3］。HAP 參與草酸鈣結(jié)石的形成，以及是如何促進(jìn)腎結(jié)石的形成的機(jī)制研究尚未明確。

草酸鈣在腎乳頭Randall 斑塊上的過度生長(zhǎng)是草酸鈣結(jié)石形成的潛在機(jī)制［4］。EVAN 等［5］通過腎臟活檢發(fā)現(xiàn)，Randall 斑起源于髓袢基底膜，隨后擴(kuò)散到了腎直小管，最后到尿路上皮表面，促進(jìn)草酸鹽晶體的成核、生長(zhǎng)和聚集，從而增加了腎結(jié)石形成的風(fēng)險(xiǎn)。在含鈣結(jié)石或尿液中發(fā)現(xiàn)了許多磷酸鈣鹽成分，最常見的磷酸鈣鹽是HAP［6］。因此，HAP 與腎結(jié)石之間存在密切的關(guān)系，腎小管上皮細(xì)胞的氧化炎癥損傷與結(jié)石的形成密切相關(guān)［7］。YU 等［8］通過將HK-2 細(xì)胞與不同濃度的HAP 和/或巨噬細(xì)胞共同培養(yǎng)，HAP 增加上調(diào)了HK-2 細(xì)胞中骨橋蛋白（OPN）的表達(dá)水平，并引起異質(zhì)的成核、粘附和晶體沉積，從而促進(jìn)了Randall 斑塊和腎結(jié)石的形成。RAO 等［9］通過研究四種不同類型的HAP（球狀、針狀、棒狀、盤狀），結(jié)果表明HAP 的細(xì)胞毒性：球狀＞針狀＞棒狀＞盤狀，HAP 的物理性質(zhì)對(duì)其細(xì)胞毒性起著至關(guān)重要的作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)HAP 可能激活細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，引發(fā)一系列細(xì)胞功能障礙、凋亡和壞死。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不同濃度的HAP 探究其通過氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)HK-2 細(xì)胞的凋亡的影響及其機(jī)制，為泌尿系結(jié)石的機(jī)制研究作一定探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑人源近端腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞武漢普諾生命科技有限公司中國(guó)）、HAP（水熱法合成、分散性好、棒狀、60～100 nm×12 nm）、MEM 培養(yǎng)基和胎牛血清（Gibco 公司 美國(guó)）、胰蛋白酶（Sigma 公司 美國(guó)）、Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡和壞死雙染料試劑盒、活細(xì)胞/死細(xì)胞染色試劑盒和DCFH-DA（上海貝博生物有限公司中國(guó)）、青霉素和鏈霉素、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）、吖啶橙（AO）染料（碧云天生物技術(shù)公司中國(guó)）、四甲基偶氮唑藍(lán)（hiazoyl blue tetrazolium dromide，MTT）（Amresco 公司美國(guó)）、Lyso-Tracker Red 和Mito-Tracker Green、過氧化氫（H2O2）試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司 中國(guó)）、Caspase-3 活性試劑盒（南京建成生物工程研究所中國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HAP 的合成和表征根據(jù)文獻(xiàn)，利用水熱法合成了HAP［10］。將樣品分散到無水乙醇中、超聲均勻分散，滴于銅網(wǎng)，干燥，用透射電子顯微鏡（TEM）進(jìn)行觀察。將樣品分散到無水乙醇中、超聲均勻分散，滴于硅片，干燥，用掃描電子顯微鏡（SEM）進(jìn)行觀察。取適量的樣品，用X-射線衍粉末射儀（XRD）對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定。取適量的樣品，用固態(tài)熒光測(cè)量?jī)x對(duì)樣品的熒光性質(zhì)進(jìn)行。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)將HK-2 細(xì)胞接種到含有10%FBS，100 μg/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的MEM培養(yǎng)基上在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，胰蛋白酶消化用于細(xì)胞繁殖，細(xì)胞同步后，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头纸M：（1）對(duì)照組：僅添加等體積PBS 溶液（0 μg/mL）；（2）HAP 處理組：將HK-2 細(xì)胞暴露于5、10、20、40、80 μg/mL 的HAP。

含HAP 的PBS 懸液的制備：將一定量的HAP粉末鋪板，用紫外線滅菌，過夜，然后分散在PBS溶液中，制備濃度為4 mg/mL 的懸浮液，并超聲處理5 min。

1.2.3 HK-2 細(xì)胞存活率和活細(xì)胞/死細(xì)胞染色檢測(cè)通過用MTT 的方法測(cè)定HK-2 細(xì)胞存活率［11］。將HK-2 細(xì)胞（2×104）接種到96 孔板上，按照上述分組分別孵育24、48、72 h，分別加入10 μL MTT，在37 ℃的條件下孵育4 h，棄去上清并加入100 μL DMSO，搖床震蕩10 min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm 的吸光度（OD）值。細(xì)胞活性=OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組×100%。

將HK-2 細(xì)胞（1×105）接種到6 孔板上，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头跤?4h，嚴(yán)格按照活死染試劑盒說明書操作，通過熒光顯微鏡觀察，綠色為活細(xì)胞，紅色為死細(xì)胞。

1.2.4 HK-2 細(xì)胞凋亡測(cè)定Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡和壞死雙染料檢測(cè)細(xì)胞凋亡［12］。將HK-2細(xì)胞（1×105）接種到6 孔板上，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头譃閮山M：（1）對(duì)照組：僅添加PBS 溶液（0 μg/mL）；（2）HAP處理組：將HK-2 細(xì)胞暴露于10、20、40 μg/mL 的HAP，孵育6、24 h，嚴(yán)格按照試劑盒的說明書步驟操作，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 HAP 在HK-2 細(xì)胞內(nèi)分布分別用Lyso-Tracker Red 或Mito-Tracker Green 追蹤HAP 在HK-2細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)分布［13］。將HK-2 細(xì)胞（2×104）接種到培養(yǎng)皿上，用HAP（40 μg/mL）處理HK-2 細(xì)胞6 h。用Lyso-Tracker Red 和Mito-Tracker Green分別給溶酶體和線粒體染色，用共聚焦顯微鏡觀察HAP 在細(xì)胞中的分布。

1.2.6 ROS 的檢測(cè)用DCFH-DA 檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)ROS 水平［14］。孵育6 h，將細(xì)胞用200 μL DCFHDA 染色，在37 ℃暗處孵育20 min，PBS 洗滌3 次后，PBS 重懸，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)氧化DCFH-DA的熒光。

嚴(yán)格按H2O2試劑盒說明書步驟操作，使用酶標(biāo)儀在415 nm 下測(cè)量吸光度。實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头纸M：（1）對(duì)照組：僅添加等體積PBS 溶液（0 μg/mL）；（2）HAP 處理組：將HK-2 細(xì)胞暴露于5、10、20、40 μg/mL 的HAP。用5 mmol/L N-乙酰半胱氨酸（NAC）預(yù)處理1 h，使用酶標(biāo)儀在570 nm 下測(cè)量吸光度。細(xì)胞活性=OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組×100%。

1.2.7 溶酶體完整性檢測(cè)吖啶橙（AO）檢測(cè)溶酶體完整性，孵育6 h，用PBS 制備的5 μg/mL 吖啶橙染料（AO）溶液染色15 min，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)通透性。

用Lyso-Tracker Red 檢測(cè)溶酶體通透性的改變。加入Lyso-Tracker Red 和Hochest，分別孵育30 min和15 min。用熒光顯微鏡觀察溶酶體的堿化。

1.2.8 線粒體膜電位（ΔΨm）和Caspase-3 檢測(cè)將HK-2 細(xì)胞（每孔1×105個(gè)細(xì)胞）接種在6 孔板中，同2.2.4 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头纸M，孵育6 h，收集細(xì)胞并以1 000 rpm/min 離心5 min，吸出上清液，用PBS洗滌，再次離心獲得細(xì)胞沉淀，加入500 μL JC-1，在黑暗中于37 ℃孵育20 min，PBS 洗滌三次除去未反應(yīng)的JC-1，并通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析細(xì)胞的線粒體膜電位的變化。

將HK-2 細(xì)胞（每孔1×105個(gè)細(xì)胞）接種在6 孔板中，孵育6 h，嚴(yán)格按照說明書裂解細(xì)胞，取少量細(xì)胞樣品用BCA 蛋白濃度定量試劑盒定量蛋白濃度以保證每組的蛋白濃度在100～200 μg。Caspase-3 活性測(cè)定嚴(yán)格按說明書操作。用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為405 nm 的吸光度（OD）。Caspase-3 活化程度=OD樣品組/OD對(duì)照組×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有結(jié)果至少作三個(gè)獨(dú)立平行實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。單因素方差分析用于多重比較，兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HAP 表征通過TEM 和SEM 對(duì)HAP 的形貌和大小進(jìn)行測(cè)定。HAP 為分散性良好的棒狀，長(zhǎng)度×高度：（60～100）nm×12 nm（圖1a、b）。利用XRD 對(duì)HAP 的結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定，通過與標(biāo)準(zhǔn)衍射圖（JCPDS No.09-0432 標(biāo)準(zhǔn)衍射圖）對(duì)比，HAP 與標(biāo)準(zhǔn)衍射圖一致，表明合成了純的HAP（圖1c）。利用固態(tài)熒光測(cè)量?jī)x檢測(cè)HAP 發(fā)藍(lán)光（圖1d）。

圖1 HAP 表征結(jié)果Fig.1 HAP characterization results

2.2 HAP 對(duì)的HK-2 細(xì)胞存活率影響MTT 法觀察不同劑量HAP 處理24、48 和72 h 對(duì)HK-2 細(xì)胞生存率的影響，見圖2a。0、5、10、20、40和80 μg/mL的HAP 處理的HK-2 細(xì)胞在24、48 和72 h 對(duì)HK-2細(xì)胞增殖均有明顯的抑制作用，并呈明顯的劑量依賴性。在24 h，HAP 在5、10 μg/mL 細(xì)胞存活率無明顯差異，約降低17%～19%，80 μg/mL 細(xì)胞存活率約降低60%。本結(jié)果顯示，HAP 抑制HK-2 細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞生存率且引起細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性且呈濃度-時(shí)間依賴性。

活細(xì)胞/死細(xì)胞染色結(jié)果表明HK-2 細(xì)胞增殖能力隨濃度的增加而降低（圖2b）HAP 在20 μg/mL后釋放紅色熒光的死細(xì)胞逐漸增多，釋放綠色熒光的活細(xì)胞逐漸減少。HAP 在5、10 μg/mL 活/死細(xì)胞未觀察到明顯差異，80 μg/mL 時(shí)僅觀察到了少量的活細(xì)胞。活/死細(xì)胞染色結(jié)果與MTT 結(jié)果基本一致。

2.3 HAP 引起的HK-2 細(xì)胞調(diào)亡由于80 μg/mL的HAP 明顯的抑制HK-2 細(xì)胞的增殖并導(dǎo)致壞死脫落。結(jié)合細(xì)胞活性和活死染結(jié)果，選擇0、10、20、40 μg/mL 的HAP 分別作用于HK-2 細(xì)胞共孵育6、24 h，凋亡結(jié)果表明6 h 細(xì)胞的存活率沒有明顯差異（圖2c），24 h 凋亡結(jié)果表明細(xì)胞的凋亡和壞死率隨著濃度的增加而升高（圖2c、d）。

圖2 HK-2 細(xì)胞凋亡結(jié)果Fig.2 Results HK-2 cell apoptosis

2.4 HAP 在HK-2 細(xì)胞中的分布見圖3，HAP的藍(lán)色熒光主要與Lyso-Tracker 標(biāo)記的溶酶體的紅色熒光重疊，與Mito-Tracker 標(biāo)記的綠色熒光僅有部分局限，結(jié)果表明HAP 主要分布在溶酶體。

2.5 HAP 誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞ROS 的釋放DCFHDA 熒光探針檢測(cè)了HAP 誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞中ROS的變化。熒光強(qiáng)度的定量結(jié)果表明，HK-2 細(xì)胞中的ROS 水平隨濃度增加增加（圖4a）。HK-2 細(xì)胞中的H2O2水平隨濃度增加增加（圖4b）。正常組的細(xì)胞具有暗熒光，表明細(xì)胞內(nèi)ROS 水平低。HAP治療組的綠色熒光均顯著增強(qiáng)（圖4d），表明HAP導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS 水平升高。乙酰半胱氨酸（NAC）是一種抗氧化劑，加入NAC，HAP 誘導(dǎo)的細(xì)胞活性較未加入NAC 的細(xì)胞生存率升高（圖4c），表明細(xì)胞的生存率與ROS 釋放有關(guān)，HAP 在5、10 μg/mL細(xì)胞存活率無明顯差異。

圖3 在暴露于40 μg/mL 的HAP 中6 h 后，HK-2 細(xì)胞中HAP 的分布（標(biāo)尺：10 μm）Fig.3 HAP distribution in HK-2 cells after 6 hours of exposure to HAP at 40 μg/mL（Scale：10 μm）

圖4 HK-2 細(xì)胞ROS 的釋放Fig.4 ROS release from HK-2 cells

2.6 HAP 對(duì)HK-2 細(xì)胞溶酶體膜完整性的影響見圖5a。HAP 可使HK-2 細(xì)胞溶酶體通透性增加，溶酶體內(nèi)的大量的水解酶釋放，溶酶體膜受損。Lyso-Tracker Red 是一種堿性染料，溶酶體紅在溶酶體內(nèi)的熒光強(qiáng)弱可間接反應(yīng)溶酶體的完整性，見圖5d。HAP 可使HK-2 細(xì)胞溶酶體完整性受損。結(jié)果表明HAP 可使HK-2 細(xì)胞溶酶體完整性受損，且呈濃度依賴性。

2.7 HAP 對(duì)HK-2 細(xì)胞線粒體功能的影響見圖5b，所示隨HAP 濃度的增加ΔΨm 降低。HAP引起的細(xì)胞內(nèi)ROS 水平升高可能導(dǎo)致ΔΨm降低。

2.8 caspase-3 的釋放caspase-3 是細(xì)胞凋亡的過程中的一種關(guān)鍵酶。見圖5c，所示隨HAP 濃度的增加caspase-3 增加。由HAP 引起的細(xì)胞ΔΨm 降低可能導(dǎo)致caspase-3 激活。

3 討論

腎結(jié)石是一種日益增長(zhǎng)的泌尿系統(tǒng)疾病，約占世界人口的5%～13%［15］。目前治療腎結(jié)石的主要方法是外科手術(shù)［16］，但患者的復(fù)發(fā)率高，5年復(fù)發(fā)率約為50%［17］。因此，了解腎結(jié)石的發(fā)病機(jī)制對(duì)結(jié)石的治療和預(yù)防復(fù)發(fā)具有重要意義。目前國(guó)內(nèi)外主要集中在草酸鈣在腎結(jié)石形成機(jī)制的探究［18］，而關(guān)于HAP 作為促進(jìn)腎結(jié)石形成的機(jī)制的研究較少。

圖5 HAP 對(duì)HK-2 細(xì)胞線粒體功能和細(xì)胞溶酶體膜完整性的影響Fig.5 Effect of HAP on mitochondrial function and lysosomal membrane integrity of HK-2 cells

近年來國(guó)內(nèi)外出現(xiàn)了關(guān)于HAP 對(duì)腎上皮細(xì)胞損傷的報(bào)道，余駿川等［19］研究了HAP 對(duì)HK-2 細(xì)胞的損傷作用，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率與HAP 的濃度呈負(fù)相關(guān)且通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)的OPN 表達(dá)參與腎結(jié)石的形成。COHENA 等［20］將草酸，草酸鈣和HAP與犬腎細(xì)胞（MDCK）共培養(yǎng)，結(jié)果表明它們都引起MDCK 細(xì)胞中基質(zhì)Gla 蛋白（MGP）表達(dá)增加，超氧化物歧化酶釋放，乳酸脫氫酶釋放，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡率，從而促進(jìn)腎結(jié)石的形成。研究表明HAP 對(duì)腎上皮細(xì)胞造成損傷，但并未對(duì)其造成損傷的機(jī)制進(jìn)一步研究。有研究表明當(dāng)300 μg/mL的HAP 會(huì)對(duì)HK-2 細(xì)胞造成不可逆的損傷，造成大量細(xì)胞凋亡［21］，所以設(shè)計(jì)的最大濃度不高于200 μg/mL，本研究通過MTT 和活細(xì)胞/死細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)HAP 可以降低HK-2 細(xì)胞的存活率，抑制細(xì)胞增殖，表明對(duì)HK-2 細(xì)胞具有一定的損傷作用。

研究表明細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)能引起細(xì)胞氧化炎癥損傷，過量的ROS 會(huì)引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致正常的腎上皮細(xì)胞功能障礙、細(xì)胞凋亡甚至死亡［22］。目前主要凋亡途徑包括線粒體和溶酶體途徑［23］，ROS 是ΔΨm 降低的直接原因［24］。當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)，造成大量ROS 釋放可引起線粒體功能障礙，包括ΔΨm 下降、bcl-2 的降低以及bcl-2 相關(guān)bax 蛋白的釋放，同時(shí)線粒體通過釋放細(xì)胞色素c進(jìn)一步活化Caspase-9，Caspase-9 又可激活下游的Caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［25］。本研究通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)HAP 可導(dǎo)致ΔΨm 明顯降低、Caspase-3 水平增加，與ROS 的上升趨勢(shì)一致。

溶酶體膜的完整性是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵因素［26］，組織蛋白酶B 是一種存在于溶酶體內(nèi)的凋亡介質(zhì)［27］，當(dāng)溶酶體膜完整性受損可導(dǎo)致組織蛋白酶B 釋放，從而導(dǎo)致細(xì)胞調(diào)亡。本研究通過共聚焦顯微鏡觀察HAP 主要分布在溶酶體內(nèi)，溶酶體膜的通透性增加，組織蛋白酶B 釋放，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

綜上，本研究對(duì)不同濃度的HAP 通過溶酶體-線粒體途徑誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞凋亡。其機(jī)制：（1）HK-2 細(xì)胞內(nèi)的ROS 釋放增加導(dǎo)致線粒體膜電位降低，激活caspase-3 導(dǎo)致HK-2 細(xì)胞凋亡；（2）HAP主要定位于HK-2 細(xì)胞的溶酶體中導(dǎo)致溶酶體膜的通透性增加，凋亡因子釋放（組織蛋白酶B）引起細(xì)胞凋亡；（3）值得注意的是HAP 作用于HK-2細(xì)胞6 h 時(shí)沒有引起細(xì)胞凋亡，但有大量ROS 產(chǎn)生、線粒體膜電位降低、caspase-3 水平升高等改變。表明凋亡的因素的出現(xiàn)早于細(xì)胞的凋亡。本研究表明HAP 能明顯的抑制HK-2 細(xì)胞增殖，并通過溶酶體-線粒體通徑介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡和壞死，從增加了結(jié)石形成的風(fēng)險(xiǎn)。