國標法和新型試劑盒法測定乳粉中生物素含量

吳艷輝，王杰偉，孫萬東，劉敏，何艷玲*

北京陸橋技術股份有限公司（北京 100123）

維生素是人體必需的一種營養素，當人體維生素缺乏時就會造成新陳代謝紊亂。如今，維生素類食品大量出現，人們對此越來越重視，維生素檢測的作用也就越發突顯[1]。

生物素是一種水溶性B族維生素，又稱維生素B7、維生素H，是人體不可缺少的營養物質，是機體中許多酶的輔酶因子，也是重要的食品添加劑之一，它在機體內碳水化合物、脂類、蛋白質和核酸的代謝過程中發揮重要作用，是動物機體維持正常生理機能所必需的維生素之一[2]。生物素主要來源于酵母、花椰菜、堅果類、蛋黃、肝臟和腎臟。由于人體腸道菌可合成一些生物素，因此一般情況下人體極少缺乏。研究表明，嬰兒腸道功能較弱，他們缺乏生物素易患舌炎和皮炎，有可能造成嚴重的神經癥狀。因此生物素常作為一種營養補充劑而被廣泛添加到嬰幼兒食品中[3]。

常用的生物素檢測方法有微生物法[4-5]、分光光度計法[6]、酶聯免疫法[7-8]、高效液相色譜法[9-11]和液相色譜質譜聯用法[12-13]等。其中微生物法是最為靈敏和應用最為廣泛的方法，也是美國、中國等國家的官方分析方法?，F行國家標準GB 5009.259—2016、美國政府機構的實驗室和FDA一直使用該方法。

此次試驗采用國標法和新型試劑盒法測定乳粉中生物素含量，利用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）對生物素的靈敏性和特異性，定量檢測樣品中生物素的含量。通過方法線性、重復性和回收率比對兩種檢測方法結果的差異，為嬰幼兒配方乳粉中生物素含量的檢測提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和樣品

標準菌株：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），ATCC 8014，菌株來源于美國標準菌種保藏中心（ATCC），現保存于實驗室。

標準乳粉質控樣品：嬰兒配方乳粉中煙酸、泛酸、葉酸、生物素定量分析質控樣品（生物素特性值26.00 μg/100 g，滿意范圍為21.56～30.44 μg/100 g），購自中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心，貨號QC-IP-705。

普通樣品：多品牌嬰幼兒配方乳粉，市售。

1.1.2 標準品和培養基

生物素標準品：純度≥99%（CAS：58-85-5），購自Sigma公司。

培養基：乳酸桿菌瓊脂培養基、乳酸桿菌肉湯培養基和生物素測定培養基，均由北京陸橋技術股份有限公司提供。

1.1.3 試劑盒

新型生物素檢測試劑盒，貨號VT3103，為北京陸橋技術股份有限公司新產品，其組成為植物乳桿菌凍干菌球、生物素凍干標品、生物素測定培養基、生物素檢測用緩沖液、無菌水、96孔微孔板，封板膜。

1.1.4 儀器與設備

高壓滅菌鍋（美國ZEALWAY公司）；pH計（METTLER TOLEDO公司）；水浴鍋（春蘭實驗儀器廠）；離心機（SIGMA公司）；生物安全柜（美國BAKER公司）；生化培養箱（德國MMM公司）；BIOTEK SYNERY4微孔板判讀儀（美國BIOTEK公司）。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線制作

國標法：參考GB 5009.259—2016[14]，配制生物素標準使用工作液，按照標準系列管制備方法，配制0.00～1.00 ng范圍內的標準品，每個梯度做3個平行。以標準系列生物素含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制國標法生物素標準曲線。

試劑盒法：取出1瓶試劑盒提供的生物素凍干標準品，用生物素緩沖液將標準品溶解混勻后，按照說明書，配制0.000，0.060，0.120，0.200，0.280，0.360，0.440和0.520 μg/100 g系列濃度的標準溶液。每個濃度做3個平行，培養后進行測定，以生物素標準品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制生物素檢測試劑盒標準曲線。

1.2.2 樣品處理

選取參考值為26 μg/100 g標準乳粉質控樣品和市售奶粉樣品，分別按照GB 5009.259—2016和試劑盒說明書對樣品進行相應處理，并進一步稀釋。

1.2.3 回收率試驗

參考國標配制100 μg/mL的生物素標準儲備液，臨用前用乙醇溶液（50%）稀釋至生物素濃度為10 μg/mL的標準工作液，精確稱取1.000 g標準乳粉質控樣品，參照加標量50%，100%和200%的水平，分別加入15，30和50 μL的標準工作液，即得加標濃度分別為15，30和50 μg/100 g的加標樣品，分別按照國標法和試劑盒說明書進行樣品處理，每份加標樣品做3個平行，培養后測定結果，計算回收率。

1.2.4 重復性試驗

分別取6份市售嬰幼兒配方乳粉，按照國標方法和試劑盒說明書進行樣品處理，參考產品營養標簽進行適當稀釋，加樣后37 ℃培養，國標法培養19～20 h，試劑盒法培養48 h，用酶標儀測定結果。

1.2.5 測定

國標法測定，參考國標并對其進一步簡化，將培養后的試管混勻，用移液器吸取200 μL混勻后的菌液，加入無菌96孔酶標板中，在波長550 nm處讀取吸光度，該方法已通過驗證，結果等同于國標分光光度計法，與之相比更快速簡便。

試劑盒法參考說明書操作，培養后將微孔板倒置于桌面，平面振蕩數次后取下密封膜，在波長630 nm或550 nm下讀取吸光度。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的制作

國標法采用Excel繪制標準曲線，生物素濃度范圍在0.01～0.1 ng/mL之間，吸光度變化曲線如圖1（a）所示。生物素標準曲線線性關系良好，線性相關系數R2=0.999。該方法定量限為4.0 μg/100 g，檢出限為2.0 μg/100 g，方法靈敏度高。

試劑盒法采用試劑盒提供的軟件制作標準曲線，生物素濃度范圍在0.000～0.520 μg/100 g之間，吸光度變化曲線如圖1（b）所示。生物素標準曲線線性關系良好，線性相關系數R2＞0.99。該方法定量限為0.06 μg/100 g，檢出限為0.02 μg/100 g，表明試劑盒方法靈敏度高，檢測數據可信度高，可以用于實際樣品的分析研究。

2.2 樣品測定

分別用國標法和新型生物素檢測試劑盒測定標準質控樣品，每種方法做6個重復，測定結果見表1。兩種方法對標準質控樣樣品的檢測值均在滿意范圍內，且6次重復試驗測定值相對標準偏差較低，國標法測定值RSD為3.22%，試劑盒法為3.18%，說明方法重現性良好，數據可靠。2種方法對標準質控樣品的測定值結果差異不顯著（p＞0.05）。

2.3 回收率試驗

對標準質控樣品進行加標回收試驗，采用國標法和試劑盒法檢測，回收率結果見表2。此次試驗對標準質控樣品在50%，100%和200%添加水平進行加標回收試驗，回收率均在90%～110%之間，回收率穩定、準確度高。每份加標樣品的3次平行試驗結果RSD值均小于10%，檢測結果符合回收率80%～120%的要求，結果在可接受范圍內[15-16]，且2種方法重現性良好。

2.4 重復性試驗

采用國標法和試劑盒法對市售6種嬰幼兒配方奶粉中生物素含量進行測定，結果見表3。生物素平均含量均高于產品標簽值，3次測定結果的RSD均小于5%，可見兩種方法測嬰幼兒乳粉中生物素的含量重復性較高，國標法比試劑盒法測定值略低，可能是前處理方法不同造成的。

表1 樣品測定結果（n=6）

表2 生物素加標回收試驗結果

表3 生物素重復性試驗結果

接表3

3 討論

此次試驗采用GB 5009.259—2016和新型生物素檢測試劑盒測定乳粉中生物素的含量，標準曲線相關系數均在0.99以上，加標回收率在90%～110%之間，精密度較高，重復性較好；定量標準質控樣品檢測的結果均在滿意范圍內且接近特性值，結果準確；兩種方法檢測結果差異不顯著（p＞0.05），C.V.值均小于10%，樣品重復性試驗結果RSD均小于5%。

生物素容易與抗生素因子結合，且油脂會促進植物乳桿菌的生長，因此試驗用到的所有玻璃器皿必須嚴格處理，清洗干凈后再于180 ℃烘烤2 h，從而去除殘留的微量生長因子。國標法樣品處理時，需要NaOH調節pH，若調過頭，必須用H2SO4調回，不得用HCl，因為HCl能使生物素失去活性；另外菌種的保存和轉種必須嚴格控制，使用前菌種需連續傳代3次以增強菌活力，提高菌種對生物素的敏感性，接種菌懸液的透光率應控制在80%左右，每支試管接菌量一致，加完后振蕩使菌液均勻地分散在培養基中。

新型生物素檢測試劑盒是按照國標方法設計的，與GB 5009.259—2016相比，前處理使用試劑盒提供的提取液進行熱提取，操作步驟簡便，無需調pH，操作誤差小，檢測時間由5～7 d縮短到44～48 h，省去菌株活化、轉接操作，檢測效率提高。與市場上同類試劑盒相比，新型生物素檢測試劑盒菌種以凍干菌球的形式保存于棕色西林瓶中，使用時加入培養基中，混勻后加入微孔，試驗操作靈活，每次試驗取一瓶菌球即可，且保證每次實驗各微孔中菌液量及活性一致，避免存放過程中微孔板污染；每個試劑盒包含3套試劑和3塊酶標板，每套試劑可檢測8～24份樣品，更適用于大批量樣品的檢測，以降低檢測成本。

4 結論

試驗表明，國標法和新型試劑盒測定乳粉中生物素含量，其標準曲線線性均良好（R2＞0.99），樣品檢測結果穩定準確、重現性好，適用于乳粉中生物素含量的測定，進一步豐富了維生素檢測方法和產品。