針刺心經神門與少海對補陽還五湯譜動學研究

蔣冰 王妙華 諶愛華 王韌 李文姣 陳思陽 鄧凱文 賀福元

〔摘要〕 目的 通過針刺大鼠心經神門與少海兩穴，觀察其對補陽還五湯譜動學的影響，驗證針藥并用可改變中藥代謝的推斷;方法 針刺大鼠心經的神門與少海;補陽還五湯血樣指紋圖譜采用高效液相色譜法測定，其條件為：（1）色譜柱：Ultimate AQ-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm;（2）檢測波長：264 nm;（3）流動相：甲醇∶水采用梯度洗脫，流速為1 mL·min-1;（4）溫度：35 ℃。譜動學采用指紋圖譜與藥物動力學相結合的總量統計矩評價方法。結果 針刺組補陽還五湯譜動學參數：總量半衰期為7.726 h，經0～24.51 h總量的95%成分被排出體外，其指紋圖譜中95%的成分的保留時間在0～92.37 min之內;而對照組補陽還五湯譜動學參數：總量半衰期為10.09 h，經0.45～28.67 h總量的95%成分被排出體外，其指紋圖譜95%的成分在0～95.59 min之內。結果顯示針刺大鼠心經神門與少海能減少補陽還五湯譜動學的半衰期，增快藥物代謝。結論 針刺經絡腧穴能調整臟腑功能，反作用于中藥代謝，其譜動學會產生明顯變化，對應藥效也會產生變化，針藥并用可改變中藥量-時-效作用規律。

〔關鍵詞〕 針藥并用;針刺;神門;少海;補陽還五湯;經絡臟象;代謝指紋圖譜;譜動學

〔中圖分類號〕R284 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.06.018

〔Abstract〕 Objective To observe the effects on the spectrokinetic of Buyang Huanwu Decoction by acupuncturing at Shenmen （TF4） and Shaohai （HT3） in heart channel of rats， to verify the inference of the combined use of acupuncture and medicine can change the metabolism of Chinese materia medica. Methods Shenmen （TF4） and Shaohai （HT3） in heart channel of rats were acupunctured. The metabolic chromatographic fingerprint of the Buyang Huanwu Decoction was determined by HPLC， under conditions of （1） Ultimate AQ-C18 column： 4.6 mm×250 mm， 5 μm; （2） the detection of wavelengths： 264 nm.; （3） the mobile phase： gradient elution by mixture of methyl cyanides and water; the mobile velocity was 1 mL·min-1; （4） the temperature： 35 ℃. Spectrokinetic used a method of total statistical moment evaluation that combines fingerprints and pharmacokinetics. Results Spectrokinetic parameters in the acupuncture group were： the half-life of the total amount was 7.726 h， and 95% of the total amount was excluded after 0～24.51 h. The retention time of 95% of the components in the fingerprint was 0～92.37 min. In the control group， the half-life of the total amount was 10.09 h， and 95% of the total amount was excluded after 0.45～28.67 h， and 95% of the fingerprint was within 0～95.59 min. The results showed that acupuncture at Shenmen （TF4） and Shaohai （HT3） in heart channel of rats could reduce the half-life of the spectrokinetic of Buyang Huanwu Decoction and increase the drug metabolism. Conclusion Acupuncture at acupoints in meridians can regulate the function of zang-fu organs， which can adversely affect the metabolism of Chinese materia medica. Its spectrokinetic changes significantly， and the corresponding drug effects also change. The combined use of acupuncture and medicine can change the amount-time-effect law of Chinese materia medica.

〔Keywords〕 acupuncture combined with medicine; acupuncture; Shenmen （TF4）; Shaohai （HT3）; Buyang Huanwu Decoction; meridian and visceral manifestations; metabolic fingerprint; spectrokinetic

眾所周知，針刺經絡腧穴可調整臟腑的功能，而這種調整程度可以通過機體對藥物的反作用體現出來[1-2]。目前，大家都非常關注中醫經絡實質臟象的研究進展，前期作者團隊提出了經絡的超分子“印跡模板”印跡屬性學說，能全面解釋目前經絡研究所遇到的各種現象和所提出諸種假說[3]。然緣于目前多將經絡實質、中醫證候實質及中藥復方作用機制分開單列研究，這種研究方法雖能各有所專，取得了一定的成果，但要完整闡明中醫臟象理論的科學內涵還需艱苦努力，不斷創新。若能將臟腑經絡實質與中藥作用整體融為一爐進行研究可能會取得事半功倍的作用。依前期論文建立的經絡超分子“印跡模板”通道結構假說，可知經絡臟腑的功能和中藥成分群二者實為“鑰-鎖”的“印跡模板”對應關系[4-5]，而針刺特定的腧穴對其印跡作用明顯。因此，中藥成分既可表現為治病用的藥物，還可作為經絡臟象規律研究的探針物質，兩者統一到超分子“印跡模板”自主作用規律，并能被針刺相應的腧穴得以明顯改變，特別是對中藥的吸收、分布、代謝、排泄等藥物動力學過程產生明顯的影響。因此，本文將經絡的腧穴與中藥的體內藥物代謝動力學（采用指紋圖譜整體表征進行藥物動力學測定，為譜動學）關聯起來，通過針刺心經的神門與少海，觀察對補陽還五湯藥物代謝動力學的差異，旨在探尋針藥并用改變藥物代謝動力學規律，為后續的經絡臟腑的超分子“印跡模板”運行規律研究奠定基礎。

補陽還五湯系清代王清任《醫林改錯》首載，由黃芪、當歸、芍藥、川芎、桃仁、紅花、地龍組成，具有補氣、通絡的功能，為治療腦中風的著名方劑，在抗血栓、抗腦血栓、抗衰老、抗血脂及免疫功能方面都有廣泛的作用[4]。本研究團隊將其與針灸聯用臨床治療腦中風的偏癱的療效變化顯著，前期展開了該方有效成分部位群抗腦血栓作用機制研究，獲得了系列成果，2017年又作為重大新藥創制藥物進行開發。鑒于本方針藥并用與藥物單用的療效改變明顯，其功能主治和大部分中藥歸心經，故擬作為歸心經的探針藥物進行研究，一則為揭示針藥并用的作用機制，二則為經絡的超分子體“印跡模板”作用屬性研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 ?儀器與試藥

Water公司的高效液相色譜儀，Breeze工作站，Waters 2487 Dual Absorbance Detector。瑞士Precisa公司的20 A型電子天平;德國Heraeus公司的高速冷凍離心機及SZ-1型快速混勻器。苦杏仁苷（批號：110820-200403）、芍藥苷（批號：110736-200629）、川芎嗪（批號：110817-200305）、阿魏酸（批號：0773-9910）均購于國家藥品生物制品檢定所，甲醇、乙腈為色譜純，蒸餾水為二次重蒸餾水，其它試劑均為分析純。其復方藥材來源為：黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus Bge.Var.monghokicus（Bgo）Hsiao干燥根;當歸為傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv）Diels的干燥根;川芎為傘形科植物川芎Iigusticumchuanxiong Hort的干燥根;赤芍為毛莨科植物芍藥Paeonia lactlora Pall的干燥根莖;桃仁為薔薇科植物桃Prunus persica（Linn）Batsch的干燥成熟種子;紅花為菊科植物紅花Carthamustinctorius L.的干燥花;地龍為環節動物門鉅蚓科動物參環毛蚓Pheretima aspergillum（perrier）的干燥主體。處方：黃芪60 g，當歸9 g，川芎6 g，赤芍9 g，桃仁9 g，紅花9 g，地龍9 g。補陽還五湯由湖南中醫藥大學藥學院中藥制劑教研室制備。Wistar大白鼠，雌雄各半，體質量220～300 g，由湖南中醫學院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（湘）2001-2004。

1.2 ?干預方法

1.2.1 ?針刺組 ?針刺穴位：取心經神門、少海。針刺方法：先將大鼠固定，穴位常規消毒，選用0.25 mm×7 mm一次性針灸針，神門、少海穴直刺0.1～0.2寸，經捻轉提插得氣（觀察大鼠的反應），得氣后行平補平瀉中強刺激，留針15 min，每5 min行針1次。每日大鼠稱重后，先按0.6 mL/100 g灌胃，再進行針刺1次，7 d為1個療程。

1.2.2 ?對照組 ?與觀察組操作同步，只將大鼠固定15 min，不取穴針刺。同樣處理7 d為1個療程。

1.2.3 ?空白組 ?空白組不取穴針刺，也不固定、不給藥，正常喂養7 d后直接取血樣進行分析。

1.3 ?藥物代謝實驗、代謝指紋圖譜與譜動學的測算

1.3.1 ?藥物代謝實驗 ?取按上述方法處理的大鼠，每組24只，每組又分4個亞組，每個亞組6只。實驗前夜禁食12 h，將補陽還五湯水提醇制得的口服液按每只0.6 mL/100 g口服給藥，分別于給藥后0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、16、24 h取血，前5個亞組取3個時間點，第6個亞組取2個時間點，由眼眶或腹主動脈定時取血漿約3 mL，并在1 h內按樣品預處理方法制備供分析用樣品液。

1.3.2 ?樣品預處理 ?將待測血漿400 μL置于尖底塑料刻度離心管中，加入三氯醋酸液1 mL，渦旋混合5 min，5 000 r/min離心10 min，取三氯醋酸層，常溫下氮氣流吹干，殘渣用甲醇50 μL溶解，取20 μL進樣。

1.3.3 ?空白血漿處理 ?取空白大鼠血樣按“樣品預處理”項下同法制得空白血漿樣。

1.3.4 ?標準品對照品液 ?苦杏仁苷：精密稱取苦杏仁苷對照品5.0 mg，用甲醇定容至5.0 mL，制得1.0 mg/mL的苦杏仁苷對照品液;芍藥苷：精密稱取芍藥苷對照品8.0 mg，用甲醇定容至10.0 mL，制得0.8 mg/mL的芍藥苷對照品液;川芎嗪對照品液：精密稱取川芎嗪對照品5.0 mg，用甲醇定容至100.0 mL，制得0.05 mg/mL的川芎嗪對照品液;阿魏酸對照品液：精密稱取阿魏酸對照品5.0 mg，用甲醇定容至1 000.0 mL，制得5.0 μg/mL的阿魏酸對照品液。

1.3.5 ?HPLC色譜條件 ?色譜柱：Ultimate AQ-C18柱，4.6 mm×250 mm，5 μm，檢測波長：264 nm，流動相∶乙腈∶水，梯度洗脫，0 min（100∶0）→10 min（100∶0）→25 min（93∶7）→35 min（87.5∶12.5）→45 min（82∶18）→55 min（75∶25）→65 min（70∶30）→70 min（67.5∶32.5）→71 min（63∶37）→80 min（60∶40）→100 min（20∶80）→115 min（0∶100）→120 min（100∶0）→123 min（100：0）;流速1.0 mL/min，UV檢測器，波長264 nm[5];溫度：35 ℃。

1.3.6 ?譜動學參數計算 ?譜動學按本團隊發表的藥物動力學、譜動學數學模型及參數計算方法計算[6-8]。

2 結果

2.1 ?針刺組、對照組與空白組的補陽還五湯代謝指紋圖譜

取定時獲得的各血樣，經預處理后，在上述色譜條件下進樣測定，得針刺組、對照組與空白組的補陽還五湯代謝指紋圖譜，如圖1-3。

2.2 ?針刺組、對照組的補陽還五湯譜動學與空白組譜動學分析

對上述獲得的不同時間的指紋圖譜進行總量統計矩分析。針刺組不同時間點代謝指紋圖譜的總量統計矩數值[6]見表1;對照組不同時間點代謝指紋圖譜的總量統計矩數值見表2;空白組不同時間點的代謝指紋圖譜的總量統計矩數值見表3。

對表1-3的血漿中成分的指數圖譜總量統計矩參數進行譜動學參數分析，其原理和方法與中藥復方成分指紋圖譜處理總量統計矩計算處理相似，將血漿指紋圖譜與藥物動力學關聯后再采用總量統計矩法進行加合計算處理，其參數多了與藥物動力學相關的時間t和與之相應的一系列參數。可先用針刺藥物組最后時間點的總吸收值減去空白血樣平均總吸收值，再除以針刺藥物組總吸收值之和的5%作初次的消除常數kn、T，采用梯形法計算出針刺藥物組、藥物組、與空白組的譜動學五個總量統計矩參數，再用針刺藥物組、藥物組的譜動學總量統計矩參數減去空白組的譜動學總量統計矩參數值得針刺藥物組、藥物組純藥物的譜動學參數，具體計算公式和過程較為復雜，可參見文獻[8]。計算結果列于表4。

由表4可知，補陽還五湯在SD大鼠體內整方譜動學的總量統計零階矩（AUCT）為1.186×108 mAu·s，一階矩坐標包括指紋圖譜出峰時間一階矩（MCRTT）為33.72 min;藥動學一階矩（MRTT）為14.56 h，即（半衰期）為10.09 h;二階矩坐標包括指紋圖譜出峰時間二階矩（VCRTT）為9.964×102 min2，即總標準差為31.57 min，藥動學二階矩（VRTT）為51.83 h2，即總標準差為7.199 h，也就是說補陽還五湯灌胃大鼠后，經10.09 h代謝50%，經0.45～28.67 h后95%的成分被排除出體外，其指紋圖譜中95%的成分保留時間在0～95.59 min之內。經針刺后，補陽還五湯在SD大鼠體內整方譜動學的總量統計零階矩（AUCT）為1.827×108 mAu·s、一階矩坐標包括指紋圖譜出峰時間一階矩（MCRTT）為30.93 min;藥動學一階矩（MRTT）為11.16 h，即t0.5（半衰期）為7.726 h;二階矩坐標包括指紋圖譜出峰時間二階矩（VCRTT）為9.823×102 min2，即總標準差為31.34 min，藥動學二階矩（VRTT）為46.42 h2，即總標準差為6.813 h，也就是說針刺并用補陽還五湯灌胃大鼠后，經7.726 h代謝50%，經0～24.51 h后95%的成分被排出體外，其指紋圖譜中95%的成分保留時間在0～92.37 min之內，因此針刺對補陽還五湯的譜動學行為有較大的影響。

3 分析與討論

中醫經過幾千年形成獨特的理論體系，包含在理、法、方、藥各環節之中。針灸與中藥同為中醫的治療手段，針藥并用一直都是各位醫家推崇的重要治療方法。戰國時期的著名醫家扁鵲就留有“針、灸、藥三者得兼，而后可與言醫”之言，并用針刺百會穴、繼用藥熨、最后服湯藥的治療方法使虢國太子起死回生。著名醫家華佗也是運用針藥合治醫好了李將軍妻子的死胎。唐代孫思邈提出“若針而不灸，灸而不針，皆非良醫也。針灸而不藥，藥不針灸，尤非良醫也。……知針知藥，固是良醫。”盡管針灸作為中醫的重要治療手段之一，在與中藥相結合治療疾病時聯合應用療效強于單獨的藥物治療，以前多從病理、藥理的角度，以效應指標（靶點）變化的強度變化來說明針藥并用的機制，但這沒有考慮到藥物對機體及機體對藥物的反作用，難以進一步深入研究針刺的作用機理，建立起客觀、易測、易表征的方法。若將針藥并用的藥物在體內的代謝變化一起進行研究，由于藥物的濃度、結構可以測定，其體內的吸收、分布、代謝與排泄也可以示蹤，再結合中醫藥超分子“印跡模板”“氣析”理論，就能建立起針刺腧穴與經絡系統、藥物作用與機體反作用藥物系統的關聯性，由藥物變化推藥效變化，由藥效推經絡效應的物質運行推理變化系統，為中藥經絡及臟象理論的研究尋找到藥物探針。在針刺腧穴、經絡、臟腑與藥物的關系中，中醫藥超分子體屬性和化學理論的“印跡模板”自主作用規律能將它們緊密聯系在一起。通過針刺腧穴，調節整合經絡系統，釋放內源性的物質，到達與其“印跡模板”相似的靶位而起到治療疾病的目，或影響藥物代謝動力學行為;而中藥是外源性的物質，通過吸收進入人體，到達與其“印跡模板”相似的靶位達到治療疾病的目的，同時機體對藥物有代謝的反作用，通過激活與其“印跡模板”相同的酶，改變藥物在吸收、分布、代謝與排泄過程轉移程度和速度，從而改變藥物對靶點作用的量-時-效強度與程度，若針刺腧穴釋放的內源性物質的“印跡模板”與藥物的“印跡模板”相同或相似，這種作用更為明顯，因此，通過分析藥物變化的程度就有可能推斷出針刺腧穴的結構特征，進而分析所屬經絡的結構特征，這樣既可建立針藥并用的研究方法，就可以藥物為探針建立經絡及臟象的研究方法，亦“以穴定經”與“針藥并用”的超分子“印跡模板”的經絡、臟腑、中藥歸經等中醫藥基礎理論研究方法[5]，本文為其償試性的方法。

本文所采用的譜動學總量統計矩法可表示宏觀統計學趨勢和預測其宏觀發展方向，通過比較測算針藥并用與單獨服用補陽還五湯的譜動學參數變化，可以探知針刺經絡腧穴能調整臟腑功能，改變藥物對其作用與代謝規律，本文證明了針刺神門與少海能改變補陽還五湯的藥物代謝動力學參數。心腦共為神明之府，又有血脈相通，心神會對腦神產生重要影響[9-10]，且有研究表明針刺心經的相關穴位可較好地抑制腦心細胞凋亡[11]，古醫集《針灸大成》中亦記載有“神門去心性之呆癡”之說，可見腦相關疾病取手少陰心經治療，其療效是相當確切的[12]。臨床對腦病的治療，心經常取極泉、少海、通里、陰郄、神門等穴[10]，本實驗則選穴神門與少海，少海為心經合穴，神門為心經之輸穴、原穴，合穴主治腑病，原穴又與原氣有關，原氣借三焦之道，輸布到五臟六腑、頭身四肢，故選擇心經的神門、少海二穴即可調節氣血，又可疏通臟腑四肢之原氣，從而達到治療腦中風的作用。而補陽還五湯中多藥歸心經，且為治療腦中風的有效方劑，因此從中醫藥理論的角度來說應歸心經，故而通過針刺心經的神門與少海，就能觀察到對補陽還五湯譜動學影響，兩者在經絡和補陽還五湯作用的“印跡模板”運行規律上實現統一，因此初步推斷神門與少海的針刺效應器上存在與補陽還五湯成分平均超分子“印跡模板”的結構特征，針刺神門與少海釋放與補陽還五湯成分相似“印跡模板”內源性物質，激活一系列因子和酶系統，從而與補陽還五湯競爭性作用于吸收、分布、代謝與排泄等轉運過程，從而使補陽還五湯的半衰期發生明顯的變化，這驗證了“以穴定經”（用經絡的穴位確定中藥歸經）研究中藥歸經、經絡與臟腑等中醫藥基礎理論的可行性。

本文采用了譜動學總量統計矩法表征補陽還五湯的藥物代謝整體變化，而藥物代謝的主要臟器有心、肝、肺、脾、腎，針刺心經神門與少海是怎樣傳遞到各臟器（經絡）進而影響到藥物代謝動力學行為的機制、補陽還五湯哪種成分起作用等問題還需進一步研究。

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