反向高效液相色譜-熒光法測定酒精飲料中吖啶的含量

蘭 梅，劉路宏，王 毅，王洪濤，張 雪，彭夢露

（1.四川宜賓五糧液集團公司質量檢測中心，四川宜賓 644007；2.四川宜賓五糧液股份有限公司質量管理部，四川宜賓 644007）

吖啶（Acridine）是一種由C、H 和N 元素構成的雜環化合物，產自石油精餾過程[1]，具有低毒性，對皮膚和黏膜有強烈的刺激性，可螯合進DNA 堿基對引起基因突變[2]。吖啶及其衍生物，常用作為染料和高級顏料[3]，從而廣泛使用于食品包裝材料生產制作和食品包裝的表面著色。隨著經濟的發展，安全與健康日益成為人們最為關注的焦點，而傳統的無機染料因其不可避免地會含有不同種類的重金屬成分[4]，在一定時期內重金屬含量一直是食品行業監控的重點，從而導致無機染料被食品周邊行業逐漸遺棄，取而代之的是不含任何重金屬成分的有機染料和有機顏料[5]，而吖啶則是有機染料和有機顏料中最為典型的代表[6]。酒精飲料是指乙醇體積分數在0.5 %以上供人飲用的飲料，主要包含各種發酵酒、蒸餾酒、配制酒及預調酒[7]。隨著經濟的發展，酒精飲料在餐桌上出現頻率也逐步升高，深受消費者的喜愛。統計數據表明，2018 年度中國食品飲料市場酒精飲料占據96.4 %的份額[8]。因各種精美的酒精飲料包裝在生產過程中不可避免地會使用吖啶類有機染料和有機顏料，加之吖啶類物質極易溶于乙醇等有機物中，從而會導致吖啶類物質污染飲料本體且長期穩定存在，目前對酒精飲料中吖啶類物質檢測還缺少有效的分析方法，故無法對其進行有效的安全監測。本研究采用高效液相色譜技術，建立了一種酒精飲料中吖啶含量的分析方法。該法樣品處理簡單，檢測靈敏度和準確度較高，檢測投入較低，適合企業開展日常檢測項目。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器

ThermoFisher 高效液相色譜儀（MultiMate 3000 標準四元系統，帶二極管陣列檢測器和熒光檢測器，Chromeleon 7.0 數據處理軟件），美國ThermoFisher公司；QUINTIX224 型電子分析天平，德國SI Analytics 公司；INTEGRAL 3型純水機，美國Millipore公司。

1.1.2 材料與試劑

酒精飲料為采購市售的黃酒、雞尾酒、啤酒、果酒及白酒；甲醇為色譜級，德國Merck 公司；乙酸為ACS 級試劑，北京百靈威科技有限公司；乙醇為色譜級，德國Merck 公司；實驗用水為超純水；吖啶標準物質，純度98%，上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 溶液配制

1.2.1 標準品稀釋液

取等體積的超純水和乙醇混合，即為50 %v/v的乙醇水溶液。

1.2.2 標準品儲存液

準確稱取吖啶標準物質0.1020 g 于100 mL 容量瓶中，并加入適量甲醇，超聲溶解后用甲醇定容至100 mL，搖勻，即得含吖啶1000 mg/L 的標準品儲存液。

1.2.3 標準品中間溶液

取1.0 mL標準品儲存液于100 mL容量瓶中，用標準品稀釋液定容至100 mL，即為含吖啶10 mg/L的中間液。

1.2.4 標準曲線配制

用標準品稀釋液將中間液逐級稀釋，配制成濃度 為1.0 μg/L、10.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L、80.0 μg/L、100.0 μg/L的標準物質工作液。

1.3 試驗方法

1.3.1 定性分析方法的研究

（1）準確稱取吖啶標準物質（純度為98 %）0.1020 g 于100 mL 的容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即為1000 mg/L的吖啶溶液，將其轉移至棕色試劑瓶中常溫避光保存。用甲醇將1000 mg/L的吖啶標準物質稀釋至100 mg/L 和1.0 mg/L,置于棕色試劑瓶內，在4 ℃環境中保存。

（2）選擇美國ThermoFisher 的AcclaimTM 120-C18（4.6×250 mm，5 μm）反相色譜柱作為分離色譜柱，進樣體積為20 μL，流動相流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，采用等度洗脫的方法進行洗脫，分別以不同體積比的甲醇水溶液作為流動相，二極管陣列檢測器開啟紫外可見光燈，以190～800 nm 的掃描范圍進行掃描，將100 mg/L 和1.0 mg/L 的標準物質進樣試驗，以確定目標化合物的最大紫外吸收波長和適宜的流動相比例。

（3）取目標化合物的最大紫外吸收波長N 作為激發波，以（N+20，650）為掃描區間，采用發射波掃描模式，將1.0 mg/L 的標準物質進樣試驗，可以確定最佳發射波長Em。確定Em 后，以Em 作為發射波長，以（200，Em-20）作為激發波掃描區間，采用激發波掃描模式，將1.0 mg/L 的標準物質進樣試驗，可以確定最佳激發波長Ex。

（4）利用熒光檢測器，采用Ex 作為激發波長，Em 作為發射波長，進樣量為20 μL，甲醇水為流動相，采用控制變量法，分別確定最佳的柱溫、流通池溫度、流動相比例等色譜條件。

1.3.2 定量分析方法

（1）檢出限和定量限的確定：取1.0 mg/L 的吖啶標準物質，用甲醇稀釋至合適濃度的溶液后測定其信噪比，取3 倍信噪比作為檢出限（S/N=3），取10倍信噪比（S/N=10）作為定量限，計算該方法的檢出限和定量限。

（2）線性相關性的研究：取100 mg/L 的吖啶標準物質用體積分數為50 %的乙醇溶液稀釋至1.0 mg/L 的中間濃度，然后再用體積分數為50%的乙醇溶液稀釋至0.1 μg/L、1.0 μg/L、10.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L、80.0 μg/L、100.0 μg/L 的工作濃度，依次進行RP-HPLC-FLD 分析，以目標物的色譜峰積分面積（Y）為縱坐標，濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線。

（3）加標回收率：分別以黃酒、雞尾酒、啤酒、果酒和白酒陰性樣品作為空白基體，配制吖啶含量為1.0 μg/L、10.0 μg/L 和100.0 μg/L 的加標樣品，將加標樣品和空白基體均經過0.22 μm 孔徑的有機系微孔濾膜過濾后進入色譜儀進行分析，采用外標法計算目標物的加標回收率。

1.3.3 精密度試驗

取100.0 mg/L的吖啶甲醇溶液，用50%vol的乙醇水溶液以及酒精飲料樣品逐級稀釋為10.0 μg/L，并分別對每個樣品進行10 次獨立的重復試驗，以考察方法的精密度。

1.3.4 樣品中目標化合物含量的測定

將市售不同品牌的黃酒、雞尾酒、啤酒、果酒和白酒經0.22 μm 孔徑的有機系微孔濾膜過濾后，分別進入色譜儀檢測以測定其中吖啶的濃度，同時對所有樣品配制濃度為1.0 μg/L 的加標樣品，經微孔過濾后進入儀器分析，以作對比。

2 結果與討論

2.1 定性分析中色譜條件的確定

2.1.1 目標化合物最大紫外可見吸收波長的確定

吖啶分子中含有一個吡啶環和兩個苯環，在不同pH 值的溶液中可呈現綠色或藍色熒光，從而吖啶吡啶具有熒光特性[6，9]。研究表明，具有熒光特性的有機物在其熒光激發光波長處均有紫外可見吸收特性。為確立吖啶的激發波長需先獲取吖啶的紫外可見吸收光譜，當采用體積比為60 %的甲醇水溶液作為流動相分析吖啶標準物質時，在40 min分析時間里僅出現1 個色譜峰，對于1.0 mg/L 和100.0 mg/L 的吖啶標準品，色譜峰面積大小有異，在不同體積比的甲醇水溶液作為流動相時，該峰保留時間和峰型有變化，在甲醇體積比為80 %時峰型最佳，而對于空白對照（甲醇）在相同的保留時間內未見任何色譜峰?；究蓴喽ù宋ㄒ簧V峰為吖啶，其在190～800 nm 范圍內的紫外可見吸收光譜如圖1，從圖1 可見，吖啶在208.71 nm、248.15 nm和356.05 nm 處均有紫外吸收峰，其中最大吸收峰在248.15 nm處。

2.1.2 熒光波長的選擇

分別用209 nm、248 nm 和356 nm 的紫外光作為激發光對吖啶進行發射光譜掃描發現，248 nm和356 nm 的紫外光均能激發出吖啶的熒光，其中波長為248 nm 的紫外光激發的熒光最為強烈，其發射光譜如圖2 所示。從圖2 可見，在248 nm 激發波長下，吖啶的發射光波長為光帶模式，位于330～550 nm 區間，其中強度最大的發射光波長為446.68 nm。當采用447 nm 作為發射波長進行激發波長掃描時，其激發波光譜如圖3 所示。從圖3 可見，當采取447 nm 作為發射光時，激發光譜呈現出雙峰，峰值波長分別為248.15 nm 和355.19 nm，其中248.15 nm 處熒光強度高于355.19 nm 處。從而，作為激發光248 nm 優于355 nm。有機物熒光強度受溫度影響，在溫度升高情況下其熒光強度會減弱，為獲得強度最強熒光，流通池溫度宜低不宜高，采用最低溫度45 ℃作為池溫。對于吖啶，熒光檢測器參數確定激發光波長為248 nm，發射光波長為447 nm，流通池溫度為45 ℃。經試驗證明，在樣品中，以上熒光檢測器條件依然可用，未發現有波長漂移現象。

2.1.3 流動相的優化

吖啶生產過程中需要在甲醇中進行重結晶從而獲得精品，因此采用甲醇作為有機相和標準物質的初始溶劑，而試驗也證實采用甲醇作為流動相比乙腈等其他有機溶劑能獲得更好的峰型和穩定性。在酒精飲料中醇類物質的含量最高可達96%，為確保酒精飲料中復雜的有機物群體不會頑固滯留于色譜柱中，故流動相中有機相比例將70%作為下限。分別采用體積分數為70%、75%、80%、85%、90 %的甲醇作為流動相，進樣量為20 μL，流速為1.0 mL/min；熒光檢測器激發波長為248 nm，發射波長為447 nm，流通池溫度為45 ℃，柱溫箱35 ℃分析100 μg/L的吖啶標準物質，其色譜峰對比圖如圖4 所示。從圖4 可發現，當甲醇比例為70 %時，目標物出峰時間較晚且半峰寬較大，而隨著甲醇比例升高，峰寬變窄，峰高也增加，但當甲醇比例為90 %時目標物出現鬼峰，當甲醇的體積比例為80%時目標化合物色譜峰高最高，故最佳流動相中甲醇的體積分數為80%，并采用等度洗脫。

2.1.4 色譜柱溫度的確定

色譜柱和流動相確定后，分別考察了30 ℃、35 ℃、40 ℃和常溫（不定溫度）情況下的目標化合物的色譜峰圖，保留時間隨溫度升高而縮短。當采用不定溫度情況下，發現當室溫波動過大時，目標物的保留時間有波動，極限情況下影響峰識別。在4 個溫度條件下目標物的響應值沒有太大的變化，唯有保留時間有偏差，考慮到室溫平均水平和節能效果，采用35 ℃作為本方法的柱溫。

2.1.5 前處理條件的選擇

吖啶易溶于有機溶劑，在水中微溶，故針對酒精飲料樣品首先考慮過濾后直接進樣。酒精飲料中乙醇含量一般為30%vol～70%vol，有機物含量較高，宜采用適用于有機物的有機系微孔濾膜。試驗中分別采用了通用型的尼龍膜和PVDF 膜，分別處理不同乙醇含量的空白樣品和加標樣品，經分析發現，尼龍膜和PVDF 膜對所有樣品的加標回收影響不大，回收率均在95%～105%之間。因此選擇通用型的尼龍膜和有機系濾膜均可，本研究最終選擇PVDF膜。

2.1.6 色譜柱及色譜條件

采用色譜柱為AcclaimTM 120-C18（4.6×250 mm，5 μm）反相色譜柱；流動相為甲醇∶水（80∶20 v/v）；流速為1.0 mL/min；熒光檢測器激發波長為248 nm，發射波長為447 nm，流通池溫度為45 ℃；柱溫箱35 ℃。當目標化合物進樣量為20 pg 時，其色譜峰圖如圖5 所示，理論塔板數為16424，峰高為3846463 counts，峰面積為436186 counts·min，半峰寬為0.103 min，拖尾因子Asm=1.23。樣品中吖啶色譜峰圖如圖5 所示，目標峰與附近雜峰分離度均＞2，分離效果良好。

2.2 定量分析方法的研究

2.2.1 工作液標準品溶劑的選擇

吖啶純化時需在甲醇中進行重結晶，故采用甲醇作為標準品儲存液的溶劑，實驗證實標準品濃度為1000 mg/L的甲醇溶液可長時間保存。本方法目標是用于酒精飲料檢測，酒精飲料中乙醇含量為0.5%vol～96%vol，試驗發現基體中乙醇濃度對圖譜目標化合物峰圖及響應影響較小，采用折中濃度作為工作液的基體，故采用體積分數為50 %的乙醇水溶液作為工作濃度標準品的稀釋溶劑。

2.2.2 檢出限和定量限的探究

將1.0 mg/L 的標準物質溶液用甲醇稀釋至0.1 μg/L 和0.01 μg/L 分別進入液相色譜分析，發現0.01 μg/L 的標準品未見明顯的色譜峰，0.1 μg/L 的標準品可見明顯色譜峰，且信噪比S/N=3.62，依據檢出限為3 倍信噪比（S/N=3）、定量限為10 倍信噪比（S/N=10）計算，可得本方法中吖啶的檢出限為0.083 μg/L，定量限為0.275 μg/L。

2.2.3 線性關系的考察

以50%vol乙醇水溶液作為基體，配制成濃度為0.1 μg/L、1.0 μg/L、10.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L、80.0 μg/L、100.0 μg/L 的工作溶液，依據本研究中建立的色譜條件和預處理方法進行分析。以目標化合物的質量濃度為橫坐標，色譜峰的積分面積為縱坐標，繪制標準曲線，獲得的標準曲線方程為Y=43382X-2492.5，（R2=0.9999）。結果發現，當標準工作液濃度高于150.0 μg/L 時，出現柱過載現象。以上結果表明，當進樣量為0.2 pg～2 μg，濃度為0.1～100.0 μg/L 時線性關系良好。同時研究過程中發現，在進樣量為0.2 pg～2 μg，濃度為0.1～100.0 μg/L 時目標化合物濃度與色譜峰峰高也呈現線性關系，回歸方程為Y=391744x-64297（R2=0.9999）。從而在使用本方法是可任意選擇色譜峰峰高和色譜峰積分面積作為響應值。

2.2.4 加標回收率的測定

分別以黃酒、雞尾酒、啤酒、果酒以及白酒為樣品，配制高濃度（100.0 μg/L）、中濃度（10.0 μg/L）和低濃度（1.0 μg/L）加標樣品，利用本研究開發的檢測方法檢測空白樣品和加標樣品中吖啶的濃度，并計算目標化合物的加標回收率，結果見表1。從表1 中可見，在5 種酒精飲料中，低濃度（1.0 μg/L）的加標回收率僅葡萄酒為47%，在50%～150%范圍之外，其余在此范圍內，而中濃度和高濃度的加標回收率良好，介于80%～110%之間。

表1 吖啶在5種酒精飲料中的回收率

2.2.5 精密度檢測

分別對標準品工作液（濃度為10 μg/L）和加標樣品（加標濃度為10 μg/L）按照選定的色譜參數進行10 次獨立的檢測試驗，記錄目標峰的峰面積和峰高，分別計算每個樣品峰面積和峰高的相對標準偏差（RSD）。結果表明，色譜峰積分面積和峰高RSD(10)介于0.5～2.0 之間。試驗結果表明，本方法進樣方式和儀器精密度良好。

2.2.6 市售樣品測定

采用本研究開發的檢測方法分別對市售的18個不同品牌的酒精飲料進行了吖啶含量的檢測，均未檢出目標化合物，同時也同步進行了樣品的加標試驗，在加標樣品中均可準確的檢測加標物質及加標量，從而表明本方法適合進行酒精飲料產品中吖啶含量的檢測。

3 結論

吖啶作為有機染料和有機顏料的重要成員，廣泛用于食品包裝。因其具備毒性和誘導基因突變的特性，食品經源于包裝材料的吖啶污染后對人體健康存在一定的風險。本文建立了一種基于液相色譜法，利用熒光檢測器測定吖啶含量的方法，適用于酒精飲料中吖啶含量的測定。本法操作簡單，無需復雜的前處理，準確度和靈敏度較高，檢測投入較低，適合酒精飲料生產企業開展酒精飲料中吖啶含量的日常檢測。