基于GC-MS技術分析日本血吸蟲寄生對釘螺代謝產物的影響

吳志蕾，何紫薇，胡 雙，石蓮琴，楊建發，鄒豐才，黃翠琴

（1. 揚州大學獸醫學院，江蘇 揚州 225000；2. 云南農業大學動物醫學院，云南 昆明 650201；3. 龍巖學院生命科學學院/福建省家畜傳染病防治與生物技術重點實驗室，福建 龍巖 360012）

0 引言

【研究意義】日本血吸蟲病是由日本血吸蟲（Schistosoma japonicum）引起的一種嚴重危害人類和動物健康、影響社會經濟發展的寄生蟲病。湖北釘螺（Oncomelania hupensis）是日本血吸蟲的唯一中間宿主，消滅釘螺是控制血吸蟲病的重要措施。因此，研究釘螺代謝物及其與日本血吸蟲寄生的關系，揭示日本血吸蟲與釘螺互作機制，可為生物滅螺提供理論基礎。【前人研究進展】 代謝組學主要研究平臺包括氣相色譜質譜聯用（GC/MS）、液相色譜質譜聯用（LC/MS）、毛細管電泳質譜聯用（CE/MS）和核磁共振等[1]。目前代謝組學技術已廣泛應用于疾病診斷、藥物開發、營養代謝等方面，在寄生蟲領域得以應用[2]。陳璐[3]運用核磁共振技術與多變量數據分析相結合的代謝組學方法，分析了減毒鼠傷寒沙門氏菌對日本血吸蟲感染小鼠的代謝組的影響，為進一步了解宿主-多病原體相互作用提供了數據。Wang 等[4]應用核磁共振（NMR）技術分析了日本血吸蟲單獨感染引發的宿主代謝上的動態變化，結果表明宿主尿樣中馬尿酸、乙酸和三羧酸循環（TCA）中間產物下降，丙酮酸和腸道菌群相關代謝物含量下降。Wu等[5]進一步研究了日本血吸蟲感染小鼠整個過程的體液和肝臟組織的代謝動態變化，結果說明小鼠感染后出現脂代謝紊亂、抑制TCA、促進糖酵解和腸道菌群失調等，還在尿樣中發現與血吸蟲病嚴重程度相關的特征性代謝產物3-脲基丙酸。越來越多的學者把代謝組學應用到弓形蟲、雞球蟲和微孢子蟲等寄生蟲研究方向，為寄生蟲病的早期預警和診斷提供基礎，并為寄生蟲病的防治提供重要依據。【本研究切入點】日本血吸蟲是公共衛生研究的重要內容，過去一直從血防的角度來預防該病的發生與傳播，但仍未能根除該病。對釘螺的研究，始終停留在日本血吸蟲中間宿主的角度來探索。目前殺滅釘螺的措施主要有藥物滅螺、生態滅螺和生物滅螺。化學藥物殺螺效果較為理想，但藥物對人和動物及環境都存在健康危害。在毛蚴感染釘螺后，釘螺會產生適應毛蚴及其本身生存的代謝產物，若用其自身的抑制劑研制新型滅螺藥，有可能切斷日本血吸蟲在釘螺體內的發育，能更有針對性的消滅陽性釘螺，保持生態平衡。【擬解決的關鍵問題】本研究采用GC-MS技術分別對有血吸蟲尾蚴寄生的釘螺和沒有尾蚴寄生的釘螺進行代謝組學分析，篩選兩者間的差異代謝產物，探索日本血吸蟲入侵釘螺后的相互作用和代謝通路，為后續釘螺的生物控制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣本分組

湖北釘螺樣本由江蘇省血吸蟲病防治研究所饋贈，均采集自野外山地、田地溝渠等適宜釘螺生存的自然環境。選擇其中活性較強的釘螺進行鏡檢觀察，辨別陽性釘螺和陰性釘螺。分別收集陽性釘螺Y組和陰性釘螺W組，每5只釘螺組織為一個樣本，每組設6個生物學重復，隨后送至上海百趣生物公司（www.biotrre.cn）提取釘螺代謝物，并進行GC-TOF-MS代謝組學檢測分析。

1.2 主要儀器

GC色譜儀（Agilent 7890A，Agilent，USA），質譜 儀 （LECO Chroma TOF PEGASUS HT，LECO，USA），研磨儀（JXFSTPRP-24，上海凈信科技有限公司）。

1.3 主要試劑

L-2-氯苯丙氨酸，購自上海恒柏生物科技有限公司；硅烷化試劑（BSTFA），含1%三甲基氯硅烷（TMCS，v/v），購自REGIS Technologies. Inc. USA；代謝物提取液：甲醇、乙腈、丙酮、水的體積比為30∶30∶30∶10。

1.4 樣品處理

1.4.1 釘螺鏡檢 （1）用滅菌4%生理鹽水清洗釘螺3遍；（2）把釘螺置于載玻片，用另一片載玻片壓破釘螺殼，加一滴生理鹽水鏡檢；（3）在顯微鏡下觀察是否有日本血吸蟲胞蚴或尾蚴的存在。發現胞蚴或尾蚴的釘螺為陽性釘螺，未發現的為陰性釘螺；（4）每5只陽性釘螺、5只陰性釘螺各為1份樣品組，陰陽性釘螺各提供6份樣品組（30個釘螺），置于凍存管中備用提取代謝物，或在液氮中保存備用。

1.4.2 釘螺代謝物的萃取 取50 mg去殼釘螺全臟器組織樣本于2 mL離心管中，加入0.4 mL提取液（甲醇、氯仿體積比為3∶1），再加入20 μL L-2氯苯丙氨酸，漩渦混勻[6]。在離心管中加入鋼珠，40 Hz研磨儀處理4 min，冰浴條件下超聲5 min。超聲結束立即將樣本置于 4℃，12 000 r·min-1離心5 min。隨后取出0.34 mL上清于2 mL進樣瓶（甲烷硅基化的）中。干燥后的代謝物加入80 μL甲氧胺鹽試劑，混勻后放入烘箱中80°C孵育0.5 h[7]。隨后每個樣品中加入100 μL BSTFA，將混合物70°C孵育2 h。

1.4.3 代謝物上機檢測 將已提取好的代謝物進行上機檢測，上機條件：Agilent 7890氣相色譜-飛行時間質譜聯用儀，配有Agilent DB-5MS毛細管柱（30 m×250 μm×0.25 μm），GC-TOF-MS 具體分析條件如下：進樣量1 μL，為不分流模式；載氣為氦氣；前進樣口吹掃流速是3 mL·min-1；柱流速是1 mL·min-1；柱溫在 50°C 保持1 min，再以 10°C·min-1的速率上升至290°C，保持7 min；前進樣口溫度280°C；傳輸線溫度270°C；離子源溫度 220°C；電離電壓-70 eV；掃描方式為30-600 m/z，掃描速率20 spectra/sec；溶劑延遲460 s[8]。

1.5 代謝物檢測方法

采用LECO公司的Chroma TOF2.3X軟件和LECOFiehnRtx5數據庫對上機得到的數據進行原始峰定性和定量，再將所得的GC-MS原始數據進行噪音數據過濾，使用內標歸一法對數據進行標準化處理[9]。過濾得到的峰面積導入SIMCA軟件（V14，Umetrics AB，Umea，Sweden），對數據進行多元變量模式識別分析。采用主成分分析（PCA）、正交矯正偏最小二乘法（OPLS-DA）對數據進行總覽和判別分析。最后根據變量重要投影值VIP（Variable Importance in the Projection）＞1和t檢驗P＜0.05的標準篩選代謝產物[10]。

1.6 代謝組學數據分析

使用LECO/Fiehn代謝組學文庫鑒定化合物，對原始數據進行預處理，通過軟件進行原始數據的提取和過濾，目的是除去噪音數據。之后通過SIMCA軟件，對歸一化后的數據進行多元變量模式識別分析[11]。本試驗中用主成分分析法對數據進行自動建模分析，用正交矯正偏最小二乘法判別分析方法最大化地凸顯模型內部與預測主成分（Predictive component）相關的差異，最后結合t檢驗的P值來篩選差異性表達代謝物，分析代謝特征[11]。

2 結果與分析

2.1 系統穩定性檢測

由內標（L-2-氯苯丙氨酸）保留時間（Retention time，min）來衡量，從表1中數據可以看到，其標準差為：0.001 771，說明系統十分穩定。

2.2 代謝組學譜圖分析

對2組共12個樣本的釘螺提取的代謝物進行GC-MS檢測后，獲得所有樣本的總離子流色譜圖（Total ion chromatogram，TIC）（圖 1），橫坐標表示出峰時間，縱坐標表示峰高，峰越高，表明物質含量越多，強度越大。每個峰對應一個或幾個組分，圖上有大量的峰，表示檢測出了大量不同物質。得到的總離子流色譜圖表明釘螺組織樣本品質良好，峰面積可進行下一步分析。

表1 內標（L-2-氯苯丙氨酸）保留時間Table1 Retention time of internal standard （L-2-chlorophenylalanine）

2.3 差異代謝物篩選

采用OPLS-DA模型第一主成分的變量重要投影值VIP＞1標準，并結合t-test進行統計檢驗，結果以P＜0.05判定為兩組有顯著差異，具有統計學意義，由此確定差異代謝產物。多元變量統計模式識別后，過濾掉不相關的正交信號，利用上述方法篩選差異性表達代謝物[12-13]。

表2中的相似度表示與LECO-Fiehn Rtx5數據庫中的匹配度，相似度＞700則鑒定為可信代謝物，相似度＜200為不確定代謝物，相似度在200～700為假定注釋。通過VIP值和t檢驗對代謝物進行篩選，及其在載荷圖中對應編號，在508個峰中篩選得到18種差異代謝產物，按差異從大到小排序為：苯甲醇、蔗糖、鄰苯二甲酸二辛酯、5-氨基戊酸、3-羥基丁酸、葉綠醇、胞嘧啶、酵母氨酸、鳥嘌呤、2-單棕櫚酸甘油酯、4-乙酰氨基丁酸、花生四烯酸、D-阿拉伯糖醇、2,4-二氨基丁酸、4-氨基丁酸、脯氨酸、纈氨酸和瓜氨酸（表2）。

從表2可以看出，在508個釘螺代謝產物中共篩選到18種差異代謝產物，其在陽性釘螺中的含量均遠低于陰性釘螺，陽性釘螺中沒有發現明顯升高的物質，結果表明日本血吸蟲寄生對釘螺的生理代謝產生了嚴重影響，其中對釘螺代謝功能影響較明顯的有以下11種代謝物。

（1）苯甲醇：陰、陽性釘螺之間差異最大的代謝產物是苯甲醇，陰性組中的含量是陽性組的765倍。苯甲醇可以影響生物降解以及葡萄糖的降解，其含量變化會影響糖代謝過程[14]。

（2）D-阿拉伯糖醇：D-阿拉伯糖醇的減少也會導致機體無法正常抑制蔗糖的代謝與吸收，抑制血糖升高和脂肪生長[15]，表明陽性釘螺糖代謝途徑嚴重受阻，導致機體能量負平衡。

圖1 全部12組釘螺樣本的GC-MS總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion chromatograms of 12 O. hupensis specimens

（3）鄰苯二甲酸二辛酯：有類似雌激素的作用，是一種潛在的內分泌干擾物，陽性組中含量降低會影響釘螺生殖功能。

（4）4-氨基丁酸：屬于非蛋白氨基酸，是一種抑制性神經遞質，可調節激素分泌[16]，是三羧酸循環的重要組成部分，其含量降低嚴重影響機體能量循環過程，導致碳氮平衡失調[17]。

（5）3-羥基丁酸：具有抑制細胞凋亡的作用[18]，其含量的減少也會嚴重紊亂機體能量代謝[19]。

（6）胞嘧啶：與脂類中某些磷脂的合成密切相關[20]，其含量的異常可影響脂類的合成代謝。

（7）酵母氨酸：作為賴氨酸合成與分解代謝途徑的中間物質，酵母氨酸減少反映出賴氨酸含量的變化，而賴氨酸是參與機體能量代謝和促進機體生長發育的重要氨基酸之一[21]，表明血吸蟲寄生嚴重阻礙了釘螺自身能量代謝功能，掠奪其營養物質。

（8）2-單棕櫚酸甘油酯：參與脂肪代謝，其含量的改變影響了脂肪正常的合成與分解。

（9）2,4-二氨基丁酸：是一種神經酰胺受體，可引起神經毒性，也是細胞壁的化學結構，其含量的降低會影響細胞的穩定性。

（10）脯氨酸：是機體重要能量來源，其代謝可以及時提供充足能量，并對細胞膜系統有著保護的功能；脯氨酸又是膠原蛋白主要組成成分，參與傷口愈合和組織修復，與免疫機制相關聯[22]，陽性組脯氨酸含量降低導致細胞滲透壓失去平衡，肝細胞發生水泡樣變性。

（11）纈氨酸：是合成一種免疫抗生素的重要中間體，能夠抑制蛋白質的分解[23]，其含量的異常影響了蛋白質的合成分解。

3 討論

3.1 日本血吸蟲寄生對釘螺代謝影響分析

關于寄生蟲與宿主的相互作用，學者大都認同，寄生蟲的寄生會影響宿主營養物質的消化吸收與能量代謝。本試驗結果也表明：陽性釘螺中差異代謝物的含量比陰性釘螺低幾倍甚至幾百倍，血吸蟲寄生造成釘螺糖代謝、能量代謝等正常功能發生障礙，損傷機體，可導致陽性釘螺死亡。

18種差異代謝物中，大多數物質都與機體糖代謝相關，其次是能量代謝。日本血吸蟲寄生釘螺后，這幾種代謝物含量有所減少，使釘螺無法正常維持機體免疫系統和酸堿度平衡，無法幫助肝臟排除氨毒，平衡血糖和膽固醇。導致宿主能量和營養的缺乏，糖代謝會異常加快使得釘螺體內糖貯存消化加速。另外，蔗糖和3-羥基丁酸與機體的能量代謝相關。蔗糖是重要的能量載體及來源，有機物合成應用到大部分原料，都需要由蔗糖裂解提供碳架，是生長和發育過程中的重要化合物[24]，其含量的異常影響了個體的生長和發育。3-羥基丁酸有著抑制細胞凋亡的作用[25]，其含量的減少也會嚴重紊亂能量代謝的功能。由此可見，日本血吸蟲尾蚴寄生釘螺后搶奪其營養和能量，嚴重紊亂釘螺的生理代謝功能。

3.2 從代謝學角度分析釘螺防治前景

日本血吸蟲病不僅危害人畜健康，還對社會經濟造成嚴重危害。雖然過去一直從血防的角度來根治該病的發生與傳播，但仍未能去除該病。該寄生蟲病地域性危害嚴重，并且缺乏快速簡易的診斷方法和有效的疫苗和藥物，好在控制和研究其唯一的中間宿主釘螺，可以有效防控該病的發生與傳播[26]。然而，傳統的滅螺手段不僅給人類和其他生物帶來致畸形、致癌等危害，還會影響環境和生態平衡。所以，需要研制新的滅螺藥劑。本研究證實日本血吸蟲的寄生對宿主釘螺的代謝、生長、生存和繁殖能力等造成不利影響，能否成功寄生則表現為釘螺與日本血吸蟲的相容性。日本血吸蟲毛蚴入侵釘螺軟體后，經母胞蚴發育、子胞蚴發育、尾蚴成熟逸出幾個階段，這個過程中釘螺會釋放出類黏液性質的化學物質，稱為毛蚴松[27]，其能否在釘螺體內生存取決于日本血吸蟲侵襲能力與宿主相互作用的結果[28]。釘螺宿主由于被寄生所導致的死亡或生殖能力下降等影響在遺傳進化上也具有重要意義。

日本血吸蟲在釘螺體內的寄生機制極其復雜，深入了解寄生蟲與宿主之間的寄生關系可對其控制、防治提供有力依據。雖然，本次研究未能明確探索出可抑制血吸蟲毛蚴在釘螺體內寄生的代謝物質，但為日本血吸蟲和釘螺的防控研究提供了新思路，今后將從代謝組學角度開展更深一步研究。