凝膠色譜凈化高效液相色譜法測(cè)定天然維生素E中苯并芘殘留量

田廣，劉敏，蘇艷麗

(1.貴航貴陽醫(yī)院，貴州 貴陽 553009；2.貴陽護(hù)理職業(yè)學(xué)院，貴州 貴陽 550081)

天然維生素E又稱生育酚、抗不育維生素或生殖維生素等，主要存在于植物油料、大豆、玉米胚芽、棉籽及葵花籽中[1]，具有抗衰老、抗腫瘤、預(yù)防及治療心血管疾病的功效，還可調(diào)節(jié)血小板的黏附和凝集功能[2]，天然維生素E已被廣泛地應(yīng)用于食品、化妝品及醫(yī)藥制品[3]。苯并芘(Benzo(a)pyrene；3,4-Benzypyrene)是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)，在瀝青、汽車尾氣、煙熏及油炸食品中均含有不同程度的苯并芘[4]，一些原料植物在種植、晾曬、運(yùn)輸或生產(chǎn)加工過程中也可能會(huì)受到苯并芘的污染[5-6]。天然維生素E的生產(chǎn)主要以植物油高溫生產(chǎn)脫臭過程的副產(chǎn)物-脫臭餾分作為原料[2]，苯并芘就不可避免地殘留于脂溶性的維生素E產(chǎn)品中[7]。目前，苯并芘的測(cè)定方法有比色法、熒光光度法及液相色譜-熒光法等，其中液相色譜-熒光法因選擇性好和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[8]。由于天然維生素E基質(zhì)的復(fù)雜性以及苯并芘的親脂性[8-9]，常用的液液萃取、固相萃取及皂化除脂等方法很難將維生素E中的基質(zhì)和維生素E選擇性分離，對(duì)天然維生素E中的苯并芘測(cè)定均不很適用[10-11]。凝膠色譜(GPC)是基于溶質(zhì)分子的流體力學(xué)體積大小進(jìn)行分離的方法，能有效去除樣品中的維生素E、植物油脂及天然色素等分子量較大的化合物[12-15]。本研究采用GPC對(duì)樣品進(jìn)行凈化，考察GPC凈化能力、優(yōu)化GPC條件及建立凝膠色譜凈化液相色譜-熒光法測(cè)定天然維生素E中苯并芘殘留量含量，為天然維生素E的質(zhì)量監(jiān)控提供有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1材料與設(shè)備

液相色譜儀(Ultimate 3000 型液相色譜儀)，配RFC3000熒光檢測(cè)器(美國戴安公司)，凝膠凈化色譜(美國)，AccuPrep GPC凝膠凈化色譜[(美國J2 Scientific公司)，配200 mm×25 mm(i.d.)],凈化柱(內(nèi)裝Bio-Beads，S-X3，38 μm～75 μm填料)，旋渦混勻器(XH-B,江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)，氮吹儀(美國，Organomation Associates 公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(laborota 4011型，法國Heidolph公司)，環(huán)己烷、乙酸乙酯及乙腈(HPLC級(jí)，美國TEDIA公司)，苯并芘標(biāo)準(zhǔn)品購自德國Dr Ehrenstorfer公司。

1.2方法

1.2.1樣品前處理 稱取樣品4.0 g(精確至0.000 1 g)于比色管(10 mL)中，加入乙酸乙酯 ∶環(huán)己烷(1 ∶1，V/V)溶解樣品并定容至10 mL，混勻后過濾膜；取樣品5.00 mL用GPC凈化，以乙酸乙酯 ∶環(huán)己烷(1 ∶1，V/V)作流動(dòng)相，流速4.7 mL/min，收集第17～25 min時(shí)的流出液。將流出液轉(zhuǎn)移至100 mL旋蒸瓶中，40 ℃下旋蒸濃縮至干，用1.00 mL乙腈溶解殘?jiān)^0.45 μm微孔濾膜后進(jìn)行液相色譜測(cè)定。

1.2.2液相色譜條件 Agilent Zorbax XDB-C18液相色譜柱(150.0 mm×4.6 mm，3.5 μm)，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流動(dòng)相乙腈 ∶水(88 ∶12，V/V)，流速1.0 mL/min，常用C18柱為色譜柱，熒光檢測(cè)器的激發(fā)波長為384 nm，發(fā)射波長為406 nm。

1.2.3GPC收集時(shí)間段的確定 用乙酸乙酯 ∶環(huán)己烷(1 ∶1，V/V)配制0.5 μg/L苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液，取5.00 mL用GPC凈化，從第10 min開始分段收集，測(cè)定回收率；以收集時(shí)間和回收率作淋洗曲線，確定收集時(shí)間段。

1.2.4GPC油脂凈化能力的測(cè)試 分別稱取1.0、2.0、4.0及6.0 g樣品于于10 mL比色管中，加入乙酸乙酯 ∶環(huán)己烷(1 ∶1,V/V)溶解樣品并定容至10 mL，混勻后過濾膜，取5.00 mL樣品用GPC凈化，收集第17～25 min時(shí)的洗脫液，濃縮后稱量殘?jiān)亓浚詺堅(jiān)Ｓ嗔康亩嗌僮鳛镚PC的凈化能力。

2 結(jié)果

2.1GPC流動(dòng)相的確定

考慮到使用流動(dòng)相作為溶解樣品的溶劑，故分別采用乙酸乙酯 ∶環(huán)己烷(1 ∶13，V/V)、乙酸乙酯 ∶環(huán)己烷(1 ∶2，V/V)、乙酸乙酯 ∶環(huán)己烷(1 ∶31，V/V)對(duì)苯并芘進(jìn)行溶解，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著乙酸乙酯比例的增加，苯并芘溶解性更好，故選擇乙酸乙酯 ∶環(huán)己烷(1 ∶1，V/V)為流動(dòng)相。

2.2GPC收集時(shí)間段的確定

GPC淋洗曲線見圖1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示苯并芘的流出時(shí)間段集中在18～24 min，為保證低含量水平的測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)將GPC收集時(shí)間段定為17～25 min。

圖1 GPC淋洗曲線

2.3GPC凈化能力

GPC凈化能力的測(cè)試結(jié)果如表1所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在第17～25 min時(shí)為收集時(shí)間段內(nèi)，GPC能對(duì)2 g維生素E進(jìn)行有效的凈化。因此實(shí)驗(yàn)選擇稱取4.0 g樣品，用乙酸乙酯 ∶環(huán)己烷(1 ∶1,V/V)稀釋至10 mL，GPC進(jìn)樣5 mL。

2.4實(shí)驗(yàn)方法評(píng)價(jià)

2.4.1線性范圍和定量限 本方法中獲得了苯并芘濃度與相應(yīng)色譜峰面積之間的良好的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.999，線性范圍為0.05～20 μg/L，相關(guān)系數(shù)均在0.999，檢測(cè)限(S/N=3)為0.02 μg/kg，定量限(S/N = 10)為0.05 μg/kg。

表1 GPC油脂凈化能力

2.4.2樣品回收率及精密度 選擇樣品本底苯并芘含量<0.05 μg/kg的6個(gè)樣本，以0.05、0.10、0.20及2.00 μg/kg濃度水平做添加回收實(shí)驗(yàn)，同時(shí)扣除本底值(0.034 5 μg/kg)，獲得4個(gè)水平的平均回收率分別為98.0%、93.3%、96.4%及98.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為3.8%、2.6%、3.6%及2.1%，添加回收率數(shù)據(jù)詳見表2。標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品及樣品添加標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜結(jié)果如圖2示。

表2 添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：A為標(biāo)準(zhǔn)溶液，B為樣品，C為樣品添加標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3 討論

目前，食品安全是一個(gè)世界性問題，由食品污染所導(dǎo)致的疾病已成為全世界最為廣泛關(guān)注的衛(wèi)生安全衛(wèi)生問題之一[16-18]。苯并芘作為一種強(qiáng)致癌物質(zhì)，它的危害也日益引起人們的重視關(guān)注，如何高效、快速的測(cè)定食品中的苯并芘含量具有重要意義[19-21]。而維生素E作為當(dāng)今人們的日常保健品，其在生產(chǎn)過程中不可避免的會(huì)引入一定量的苯并芘，因此，如何從維生素E中快速，準(zhǔn)確的鑒定其含量，事關(guān)食用者的健康[22-24]。然而，目前對(duì)其進(jìn)行的研究鮮有報(bào)道，且已有方法檢測(cè)限較低，操作繁瑣[10-11]。為此，為了克服上述缺點(diǎn)，本研究采用GPC凈化-高效液相聯(lián)用技術(shù)來簡化操作，提高檢測(cè)限。實(shí)驗(yàn)用乙酸乙酯：環(huán)己烷(1 ∶1，V/V)直接對(duì)天然維生素E樣品進(jìn)行溶解，GPC凈化，有效地去除了天然維生素E膠囊中的天然維生素E、植物油脂、明膠、甘油、天然色素等雜質(zhì)，最大限度的保留的其中的并(a)芘，結(jié)合高效液相色譜-熒光檢測(cè)測(cè)定植物油維生素E中的苯并(a)芘含量。本方法采用GPC凈化有效地去除了天然維生素E膠囊中的天然維生素E、植物油脂、明膠、甘油、天然色素等雜質(zhì),使得本方法靈敏度大大提高、回收率好、重現(xiàn)性好及沒有雜質(zhì)干擾，提示可應(yīng)用于天然維生素E中苯并(a)芘的檢測(cè)。

綜上所述，本研究成功建立成功建立天然維生素E中苯并芘殘留量測(cè)定的GPC凈化、高效液相色譜法，該法在0.1～20.0 μg/L的濃度范圍內(nèi)，色譜峰面積與其濃度之間線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999，檢測(cè)限(S/N=3)為0.02 μg/kg，定量限(S/N=10)為0.05 μg/kg；具有操作簡便、選擇性好、靈敏度高及重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。