正交實驗法優化土壤堿解氮最佳測定方法

戴 域，李守權，羅 浩

(貴州省地質礦產中心實驗室，貴州 貴陽 550018)

土壤堿解氮常作為土壤氮素有效性的指標，能夠確切反映近期內土壤的供氮水平[1]。精確衡量土壤的供氮能力，進行有效施肥，不但確保了農業的增產增收，對我國的農業生產發展和控制土壤污染具有重要而深遠的意義。

目前，土壤堿解氮一般通過堿解擴散法測定，此法所采用的擴散皿在測定過程中極易引起交叉污染，易導致結果偏差[2]。對此，通過單次單因子法結合全自動定氮儀測定土壤堿解氮被廣泛應用[3]，但單次單因子法只能討論單因素影響，無法考察各因素間的交互作用，難以得到精準的測定結果。因此，優化篩選土壤堿解氮最佳測定條件尤為重要。

正交實驗設計通過挑選具備了“均勻分散，齊整可比”的代表性點進行全面實驗，此法相較于單次單因子法，可分析多因素間存在的交互作用，是一種高效、快速、經濟的實驗設計方法[4]。利用正交實驗結合定氮儀優化土壤堿解氮測定的最佳條件研究尚未見報道。為了精確測定土壤堿解氮，本研究通過參考LY/T 1228-2015(4)森林土壤氮的測定，初步確定正交實驗影響堿解氮含量的稱樣量、NaOH溶液和蒸餾時間等因素和水平選擇，最終篩選測定土壤堿解氮的最佳條件。本文所用實驗方法及評價標準可望為土壤堿解氮測定最佳條件篩選提供參考。

1 實 驗

1.1 試劑和儀器

試劑：0.01 mol/L鹽酸標準溶液、40%氫氧化鈉溶液、2%硼酸、鐵粉、混合指示劑(溴甲酚綠∶甲基紅=5∶1)，均為分析純，天津市科密歐化學試劑開發中心；超純水，自制。

儀器：K1100F全自動凱氏定氮儀，海能儀器有限公司；AY120電子天平，島津公司；瑪瑙研磨缽。

1.2 實驗方法

1.2.1 土壤堿解氮的測定

稱取經過孔徑篩的風干土壤與1 g鐵粉在瑪瑙研磨缽中均勻研磨后裝入消化管置于定氮儀，將40%氫氧化鈉溶液、2%含有混合指示劑的硼酸溶液、0.01 mol/L標準鹽酸溶液和超純水連接定氮儀；并設置有效參數進行測試；待消化管內的液體呈黑色，蒸餾完全后，用0.01 mol/L的鹽酸標準溶液滴定接收杯中的餾出液，由藍色變為紫紅色為盡頭，記錄滴定體積。同時做3次空白對照實驗。

1.2.2 堿解氮含量、絕對偏差、準確度及精密度的計算公式

凱氏定氮法測定堿解氮含量的允許偏差見表1，土壤堿解氮含量、絕對偏差、準確度及精密度計算公式如下所示。

表1 允許偏差Table 1 Margin of error

d=Ci-Cs

式中：WN為土壤堿解氮的含量，mg/kg；V和V0分別為滴定樣品溶液和空白溶液所用標準鹽酸溶液的體積，mL；c為鹽酸標準溶液的濃度，mol/L；14為氮原子的毫摩爾質量，mg/mmol；m為風干土壤質量，g；d、Ci和Cs分別為堿解氮含量絕對偏差、標準物質單次測量值和標準物質推薦值，mg/kg；RE和RSD分別為準確度和精密度，%；n為每個標準物質測量次數。

1.2.3 單因素實驗

為了準確測定土壤堿解氮，通過正交實驗優化出最佳測定條件。合理確定堿解氮測定的影響因素尤為重要，其中鐵粉、混合指示劑的硼酸和蒸餾水的用量有相對固定的要求，鐵粉、混合指示劑的硼酸和蒸餾水分別為1 g、15 mL和30 mL。因此，以上三個影響因素不作考慮。選取稱樣量、40% NaOH溶液用量和蒸餾時間為自變量，參考LY/ T 1228-2015(4)森林土壤氮的測定確定設計三因素三水平正交實驗。

標準物質多用于多目標區域地球化學調查與評價、土壤地力調查與評價及生態環境研究土壤有效態樣品分析的量值及質量監控標準[5]。選取國家一級標準物質GBW07413a(ASA-2a)重復析5次，絕對偏差的平均值為實驗指標(Y mg/kg)，最終得到實驗指標值越低，則表明單因素的水平條件更優。

1.3 正交實驗

根據正交實驗的設計原理，參照LY/T 1228-2015(4)森林土壤氮的測定，綜合單因素分析結果確立正交實驗因素水平，采用正交實驗對土壤堿解氮的測定條件進行優化篩選，并將最佳實驗方法進行驗證。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗影響

2.1.1 稱樣量的影響

分別稱取1、2、3、4、5 g土壤與1 g的鐵粉研磨混合后置于消化管中，設置定氮儀的參數(40%氫氧化鈉溶液45 mL、硼酸15 mL、純水30 mL、蒸餾時間6 min)進行測試，稱樣量對土壤堿解氮絕對偏差的影響如圖1所示。

圖1 稱樣量對土壤堿解氮絕對偏差的影響Fig.1 The effect of weighing sample on the absolute deviation of alkali-hydrolyzabla nitrogen content in soil

由圖1可知，測得土壤堿解氮的絕對偏差均在允許偏差(表1)范圍內，隨著稱樣量的增加絕對偏差呈現出先降低后升高的趨勢，當稱樣量達到2 g時絕對偏差最低，隨后絕對偏差明顯升高。因此，稱樣量的水平應設置為1～3 g。

2.1.2 NaOH溶液用量的影響

稱取2 g樣品與1 g還原性鐵粉置于消化管中，設置凱氏定氮儀的參數，其中氫氧化鈉溶液用量5、15、25、35、45 mL，其余參數分別為硼酸15 mL、純水30 mL、蒸餾時間6 min上進行測試，40% NaOH溶液用量對土壤堿解氮絕對偏差的影響如圖2所示。

圖2 40%NaOH溶液用量對土壤堿解氮絕對偏差的影響Fig.2 The effect of 40% NaOH solution on the absolute deviation of alkali-hydrolyzabla nitrogen content in soil

由圖2可知，5 mL 40% NaOH溶液時堿解氮含量的絕對偏差超出允許偏差(表1)范圍，在15～45 mL時的絕對偏差均在允許范圍內，用量在15 mL和45 mL時絕對偏差相差不大，為了避免不必要的浪費，選取40% NaOH溶液用量的水平應設置為15～35 mL。

2.1.3 蒸餾時間的影響

分別稱取1 g樣品與1 g的鐵粉研磨混合后置于消化管中，設置凱氏定氮儀的參數，其中蒸餾時間2、3、4、5、6 min，其余參數分別為氫氧化鈉溶液用量25 mL、硼酸15 mL、純水30 mL、上進行測試，蒸餾時間對土壤堿解氮絕對偏差的影響如圖3所示。

圖3 蒸餾時間對土壤堿解氮絕對偏差的影響Fig.3 The effect of distillation time on the absolute deviation of alkali-hydrolyzabla nitrogen content in soil

由圖3可知，隨著蒸餾時間的延長，土壤堿解氮測得的絕對偏差先逐漸減小，在4 min達到最低值，而后逐漸升高；蒸餾時間在2 min和6 min時，絕對偏差超出允許偏差(表1)范圍。因此，蒸餾時間的水平應設置為4～5 min。

2.2 正交實驗分析

2.2.1 實驗因素與水平的確立

依據單因素實驗結果分析可知，設置實驗因素及水平范圍，列于表2中。其中自變量A、B和C分別為稱樣量、NaOH溶液用量和蒸餾時間。

表2 正交實驗因素水平Table 2 Orthogonal test factor and level setting

2.2.2 正交實驗表安排及實驗結果分析

采用正交實驗助手軟件對正交實驗L9(33)結果(表3)進行實驗，建立響應值(Y)與稱樣量(A)、40% NaOH(aq)用量(B)和蒸餾時間(C)3個因素變量之間的關系，并對極差進行分析。

表3 正交實驗表安排及實驗指標分析Table 3 Orthogonal test table arrangement and experiment result analysis

續表3

通常，極差反應各因素水平變化對實驗指標的影響。極差越大，代表著在該因素條件下的水平對指標的影響越大[6]。F比值的大小影響各因素水平實驗指標的判斷。當因素的F比值大于F(0.1)臨界值時，則表明該因素對實驗影響顯著。由極差分析和F值可得，影響土壤堿解氮含量的因素依次為：40% NaOH溶液mL>蒸餾時間 min>稱樣量g。最佳測定方法為：A1B2C2，即為稱樣量1 g、40% NaOH溶液25 mL和蒸餾時間4 min。

40% NaOH溶液的用量對測得土壤堿解氮含量影響最大，成為準確測定土壤堿解氮的關鍵。測定堿解氮的原理是通過堿液處理土壤進行水解，它是銨態氮、硝態氮、氨基酸、酰胺和易水解的蛋白質的總和。當40% NaOH溶液用量過低或過高時，分別造成土壤水解不完全和不屬于堿解氮成分的難水解蛋白質發生部分水解，致使絕對偏差均發生偏高現象[7]。

其次，影響土壤堿解氮測定含的是蒸餾時間。蒸餾時間對土壤溶液在蒸餾的過程中氨氣是否蒸餾完全產生直接影響，從而致使滴定體積存在明顯偏差。當蒸餾時間為2～3 min時，由于蒸餾時間過短而造成堿解氮含量偏低，樣品中仍有部分未被蒸餾完全的銨態氮等存在；延長蒸餾時間至5～6 min時，雖能將土壤溶液中銨態氮等全部蒸餾出來，但滴定時間過長也會引起一部分氮元素損失。因此，蒸餾時間一般為4 min時最為適宜。此時，測定堿解氮含量的絕對偏差最小，測得土壤堿解氮含量最為精確。一般地，當蒸餾時間達到土壤樣品能夠水解完全時，適當的減少蒸餾時間也可準確的測定土壤中的堿解氮含量。

稱樣量對測定土壤堿解氮含量的影響較小。一般地，稱樣量在1～2 g范圍內對堿解氮影響不大，均能準確測定堿解氮含量。

2.3 驗證土壤堿解氮最佳測定方法

根據正交實驗篩選出土壤全氮最佳測定方法確定為：稱樣量1 g、40% NaOH溶液15 mL和蒸餾時間4 min。為驗證土壤堿解氮最佳測定方法的可靠性，利用以上最佳測定方法進行10種土壤有效態成分分析標準物質(ASA系列)重復進行12次堿解氮含量測實驗證，測定的土壤堿解氮(如表4所示)均在允許偏差范圍內。證明采用正交實驗篩選出的土壤堿解氮最佳測定方法較為合理。

表4 土壤堿解氮最佳測定方法的測定結果Table 4 The results of the best method for the determination of alkali-hydrolyzabla nitrogen content in soil

3 結 論

通過參考LY/T 1228-2015(4)森林土壤氮的測定，為正交實驗的因素與水平設置提供了參考范圍。應用正交實驗結合全自動凱氏定氮儀對土壤堿解氮測定條件的影響依次為：40% NaOH溶液mL>蒸餾時間 min>稱樣量g。土壤堿解氮最佳測定方法確定為：稱樣量1 g、40% NaOH溶液25 mL和蒸餾時間4 min。

以最佳測定方法進行土壤成分分析標準物質(ASA系列)驗證，測定的土壤堿解氮均在允許偏差范圍內。證明本研究所用實驗方法及評價標準可用于優化土壤堿解氮最佳測定方法。