叉葉茅膏菜組培快繁的研究

許 鳳，張藝萍,,宋 杰，楊秀梅，王麗花，蘇 艷，張麗芳，瞿素萍*

(1.云南省農業科學院 花卉研究所，云南 昆明 650205；2.國家觀賞園藝工程研究中心，云南 昆明 650205；3.云南省花卉育種重點實驗室，云南 昆明 650205)

茅膏菜(DroseraspatulataJ. E. Smith)為茅膏菜科(Droseraceae)茅膏菜屬(Drosera)植物，又稱石龍牙草、地上明珠等，在我國主要分布于長江以南和東北等地區，生于潮濕的山坡草地、灌叢、疏林及小溪流旁邊等[1-2]。作為藥用植物，茅膏菜具有解瘡毒等功效[3]，同時其新奇的外形以及所獨有的食蟲植物的特殊形態結構,在花卉園藝界有著相當高的觀賞價值，是一種極具經濟價值的植物[4-7]。目前，有關茅膏菜屬植物的研究主要集中于其藥用價值[8-16]、食蟲機制[17-18]、生態學研究[18-19]，對于其繁育技術的研究只限于少數種[20-24]。

隨著市場需求量的不斷增大，現有茅膏菜的數量已經供不應求，同時由于生態環境日益受損，濕地及林地資源不斷縮減，茅膏菜家族已經瀕臨滅絕[25],對茅膏菜進行組織培養和離體快繁,可短期內培養出大量生長健壯、均勻一致的優質種苗,能夠有效挽救匱乏的種質資源，填補市場供應的空缺。目前，并未見有關于叉葉茅膏菜組織培養的報道,因此本研究對于食蟲植物的資源保護及應用推廣具有重要意義[22]。

1 材料與方法

1.1 材料

供試叉葉茅膏菜為2018年引自浙江省嘉興市，栽植于云南省農業科學院花卉研究所品種資源圃。于春夏季茅膏菜生長旺盛季節，花序伸直未顯色時，剪下作為外植體。

1.2 外植體的消毒

參照楊爽等[22]的方法，并進行改進。具體方法為：將剪下的花序，用洗衣粉水清洗一遍后，在自來水下沖洗15～20 min。放入超凈工作臺，使用75%酒精處理30 s，再用0.15%氯化汞溶液處理5～8 min，之后用0.5%次氯酸鈉混合液(100 mL 0.5%次氯酸鈉溶液加入2滴吐溫20配制而成)消毒10～20 min，具體設置見表1，最后用無菌水沖洗5次。

表1 外植體消毒試驗

1.3 愈傷組織的誘導

外植體消毒完成后，用無菌濾紙將表面水分吸干，把花序底部的花序軸切除0.5 cm左右，然后把處理好的花序接種于不同的誘導培養基上進行愈傷組織誘導。愈傷組織誘導培養基以MS為基本培養基，設置不同濃度的6-BA、KT、NAA共組成6個組合(表2)。

表2 愈傷組織誘導培養基

1.4 叉葉茅膏菜的愈傷組織分化

選取生長情況一致的愈傷組織團，每團0.1 g，以MS為基本培養基，根據表3中的組合。每個組合分別接種3瓶，每瓶接種5團愈傷組織。在光照16 h/8 h(光/暗)，溫度25 ℃/15 ℃(白天/晝夜)的條件下培養20 d后，對愈傷組織分化率、叢生芽苗高度、叢生芽狀態進行觀察并統計(表3)。

表3 愈傷組織分化培養基

2 結果與分析

2.1 不同消毒劑組合對叉葉茅膏菜花序消毒效果的影響

不同的消毒劑組合及處理時間對叉葉茅膏菜花序的消毒效果見表4。從表4可以看出，相同時間的氯化汞處理后，隨著次氯酸鈉混合液處理時間的延長，外植體的污染率呈現下降趨勢，而褐化率卻呈上升的趨勢，外植體成活率呈上升的趨勢，這表明在氯化汞處理時間不變的前提下，延長次氯酸鈉混合液的處理時間可有效降低污染率，但時間過長又會對供試材料產生傷害，導致褐化率升高，進而影響成活率。同時，在次氯酸鈉混合液處理時間相同時，延長氯化汞的處理時間，污染率降低，但褐化率卻升高。

表4 花序消毒試驗結果

因此，本研究認為叉葉茅膏菜花序消毒的最適宜方法：75%酒精處理30 s后用0.15%氯化汞溶液消毒8 min，之后用0.5%次氯酸混合液處理15 min。

2.2 不同生長調節及誘導叉葉茅膏菜愈傷組織發生的影響

由表5可以看出，當NAA的濃度相同時，隨著6-BA、KT濃度的提高，愈傷組織團的形成時間縮短，且愈傷組織的狀態從致密向疏松變化。同時，從圖1可以看出，當6-BA、KT的濃度達到2.0 mg/L時，愈傷組織出現玻璃化現象，因此，叉葉茅膏菜愈傷組織誘導培養基應選擇B2、B5培養基。

圖1 不同植物生長調節劑影響下產生的愈傷組織

表5 不同生長調節劑誘導叉葉茅膏菜愈傷組織發生的影響

2.3 不同植物生長調節劑對叉葉茅膏菜愈傷組織分化的影響

將B2和B5培養基誘導出的狀態良好的愈傷組織轉接到8種不同的分化培養基上。從表6和圖2可以看出，相同濃度的不同植物生長調節劑對愈傷組織分化的影響是不同的，綜合愈傷組織分化率、叢生芽高度、叢生芽狀態來看，可以得出，對于愈傷組織分化影響的大小依次為：ZT>KT>6-BA>TDZ。相同的生長調節劑，不同濃度對愈傷組織分化的影響也是不同的，當ZT為0.5 mg/L時，芽較高，葉片過粗，生長過于成熟，不利于下一步進行叢生苗增殖培養；當ZT為0.1 mg/L，叢生苗高度適中，生長一致，叢生芽較多。因此，綜合上述分析結果，本研究認為MS+ZT 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L是叉葉茅膏菜愈傷組織分化的最佳培養基。

圖2 不同生長調節劑對叉葉茅膏菜愈傷組織分化的影響

表6 不同植物生長調節劑對叉葉茅膏菜愈傷組織分化的影響

2.4 叉葉茅膏菜的生根與移栽

叉葉茅膏菜叢生苗高度為2.5 cm左右時，將其接入到不加植物生長調節劑的MS培養基中培養10～15 d，再轉入到MS+IBA 0.3 mg/L+NAA 0.1 g/L+活性炭0.2 g/L+瓊脂6 g/L+蔗糖15 g/L的生根培養基中。

將根長0.5 cm左右的幼苗連瓶轉移到覆蓋遮陽網的小拱棚中放置3～5 d，之后放入0.1%的百菌清液中浸泡10 min，沖洗干凈，插入消毒過的且含飽和水的栽培基質(珍珠巖∶草炭=1.5∶1)中。

將種好苗的穴盤放入含接水盤的育苗箱中，之后放入覆蓋遮陽率80%的小拱棚中，10 d后將育苗箱頂部的透氣孔打開，之后每隔10 d向接水盤中注水進行浸盆，30 d后可獲得移栽成活的苗。

3 討論

建立叉葉茅膏菜組培快繁體系的首要目標是得到干凈無菌的材料，本研究結果表明：叉葉茅膏菜花序外植體最佳的消毒方法組合：75%酒精30 s+0.15%氯化汞8 min+0.5%次氯酸混合液15 min。這與張國慶[20]的70%酒精30 s+0.1%氯化汞8 min、靖晶等[21]的75%酒精5 s+0.1%氯化汞5 min、楊爽等[22]的75%酒精30～60 s+0.1%氯化汞5～10 min有一定的差異。可能與本研究所用材料為花序，且為不同的品種有關。

本研究認為誘導叉葉茅膏菜產生愈傷組織的最適宜培養基：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L、MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。在低濃度的6-BA和KT培養基中，叉葉茅膏菜雖然能產生愈傷組織，但時間較長，誘導率較低；在高濃度的6-BA和KT培養基中，誘導愈傷組織的效率較高，但是愈傷組織的狀態為顆粒狀且顏色為紫紅色，不利于下一步愈傷組織的分化。

研究不同的生長調節劑及濃度對叉葉茅膏菜愈傷組織分化的影響，6-BA、KT、ZT、TDZ都能誘導愈傷組織分化，在相同濃度的生長調節劑作用下，以ZT的效果最好，分化出的芽較健壯；在高濃度的生長調節劑作用下，分化出的芽呈黃綠色或黃色，尤其當TDZ 1.0 mg/L時，分化出的芽還出現玻璃化現象，因此，適于叉葉茅膏菜愈傷組織分化的培養基為MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

4 結論

綜上所述，對于叉葉茅膏菜最佳組培快繁體系的建立，最佳消毒處理方式：75%酒精30 s+0.15%氯化汞8 min+0.5%次氯酸混合液15 min；愈傷組織誘導的最適宜培養基：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L、MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；愈傷組織分化的適宜培養基：MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L。