離子液體預處理對奇崗草木素脫除率及酶解效率的影響

周全偉 王 超，* 楊桂花 許 鳳，2 張 凱 陳嘉川，*

（1.齊魯工業大學（山東省科學院）生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室/制漿造紙科學與技術教育部重點實驗室，山東濟南，250353；2.北京林業大學林木生物質化學北京市重點實驗室，北京，100083）

為了緩解能源危機，儲量豐富且來源廣泛的農林生物質可以用來生產燃料乙醇，因而在能源領域備受關注。農林生物質細胞壁的主要組分為纖維素、半纖維素和木素，其中木素復雜的化學結構致使生物質細胞壁結構具有頑抗性[1]。為了促進農林生物質的高效轉化，需要降低木素結構的頑抗性，增加纖維素水解的可及性[2-3]。因此，高效脫木素對農林生物質高值化利用具有重要現實意義。當前基于脫除木素的預處理方法有物理法（機械粉碎、熱解、蒸汽預處理等）、化學法（酸預處理、堿預處理等）、生物法（微生物和酶）等[4-5]，其中化學法[6]使用乙醇等化學溶劑脫除木素。通過預處理脫除木素進一步促進了生物質的利用，緩解了能源危機，但其存在處理效率低、腐蝕設備、對環境產生污染等缺點。

離子液體是一種新型綠色溶劑，具有良好的熱穩定性和環境兼容性。2002 年，Swatloski 等人[7]首次發現咪唑類離子液體可以溶解纖維素。之后，離子液體處理生物質得到了廣泛研究[8-10]。相比于其他預處理方式，離子液體預處理方式有其獨特的優勢。Li 等人[11]使用稀酸和離子液體[C2mim][OAc]分別處理柳枝稷，發現離子液體處理效率更高，且原料降解損失較少。Sathitsuksanoh 等人[12]使用離子液體[C2mim][OAc]預處理芒草、麥草和松木3種原料并酶水解制備可再生化學品，重點研究了木素在經過離子液體、酶水解等處理后的結構變化。但咪唑類離子液體存在成本高、毒性大、回收困難等問題，因而限制了離子液體的生物質工業化進程[13]。新型醇胺類離子液體因其具備良好的生物兼容性、成本低且制備過程簡單等優點近年來受到研究者的關注。Sun 等人[14]合成了醇胺醋酸鹽并用來預處理柳枝稷糖化發酵制生物乙醇。但這些報道并沒有探究離子液體處理對生物質原料物理化學性質的影響。

奇崗草具有種植簡單、再生能力強、產量高、纖維品質好、灰分含量低等優點，是一種有潛力的能源植物[15]。與農業廢棄物相比，對奇崗草的離子液體處理研究較少。因此本研究利用低成本的離子液體乙醇胺醋酸鹽[EOA][OAc]對奇崗草進行預處理，優化確定脫木素預處理工藝條件，以提高奇崗草的酶水解效率。通過掃描電子顯微鏡、X 射線衍射和紅外光譜等表征方法，探索奇崗草經預處理后的物理化學特性變化，旨在為農林生物質的高值化利用提供理論指導。

1 實 驗

1.1 實驗原料

奇崗草，取自北京林業大學實驗林區。首先，將風干后的奇崗草原料粉碎，取40～60目奇崗草進行甲苯/乙醇（2∶1，體積比）抽提6 h，風干過夜，然后置于105℃烘箱中干燥24 h，儲存備用。甲苯、乙醇、乙酸、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺等試劑購自國藥集團；離子液體1-丁基-3-甲基-咪唑醋酸鹽（[BMIM][OAc]）、1-丁基-3-甲基-咪唑氯鹽（[BMIM][Cl]）購自林州市科能材料科技有限公司；Cellucast 1.5 L（混合酶）購自青島中新國際貿易有限公司。

根據文獻報道[16]，按照乙酸與醇胺（乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺）1.1∶1的摩爾比，將乙酸逐滴加入到醇胺溶液中，在50℃下攪拌反應48 h（500 r/min），旋轉蒸發除去過量乙酸，60℃下真空干燥48 h，得到離子液體乙醇胺醋酸鹽（[EOA][OAc]）、二乙醇胺醋酸鹽（[DEOA][OAc]）、三乙醇胺醋酸鹽（[TEOA][OAc]）。表1為本實驗所用離子液體的化學結構。

表1 離子液體的陽離子、陰離子化學結構

1.2 離子液體預處理

將奇崗草和離子液體加入75 mL 耐壓瓶中，放置反應器中并加熱至設定溫度，開始計時，磁力攪拌，轉速為500 r/min。反應結束后，冷卻15 min，加入200 mL乙醇/水（1∶1，體積比）混合溶液終止反應。將混合體系在高轉速（1200 r/min）條件下攪拌過夜。減壓抽濾，用乙醇/水溶液多次洗滌，將回收的奇崗草干燥備用。

1.3 奇崗草分析表征

1.3.1 組分分析

奇崗草預處理前后樣品的組分分析參考NREL[17]流程進行測定。采用兩步酸解法測定聚葡萄糖、聚木糖和木素含量；木素脫除率和固體殘渣率分別按式(1)和式(2)計算。

1.3.2 紅外光譜（FT-IR）分析

對樣品進行FT-IR（Bruker,VERTEX70,德國）分析。測定試樣經溴化鉀壓片法得到，干燥后的樣品與溴化鉀的質量比為1∶100。每個樣品在600～4500 cm-1波數范圍內檢測，掃描次數為32次。

1.3.3 X射線衍射（XRD）分析

采用X 射線衍射儀（Bruker AXS D8，德國）對離子液體預處理前后的奇崗草樣品的纖維素晶型及結晶度進行測定。將干燥后的樣品平鋪在載玻片上，將載玻片放置于XRD 樣品架上進行數據采集，掃描范圍2θ為5°～80°。纖維素結晶度指數按照式(3)計算。

式中，CrI 為結晶度，%；I(002)為2θ=22°處的（002）晶面衍射強度；I(am)為2θ=18°處的無定形區衍射強度。

1.3.4 掃描電子顯微鏡（SEM）分析

將離子液體預處理前后的奇崗草樣品干燥后進行噴金處理，置于SEM（COXEM，30 PLUS，韓國）下掃描分析。

1.4 酶水解實驗

離子液體預處理前后的奇崗草樣品酶水解實驗步驟如下：稱取0.3 g 酶解底物放入50 mL 酶解瓶中，加入15 mL pH 值為4.8的檸檬酸/檸檬酸鈉緩存溶液，加入纖維素酶，酶用量為20 FPU/g底物，密封后放置于溫度為50℃的恒溫搖床中酶水解72 h,設定轉速為150 r/min，定時取樣，滅活后放置冰箱中冷凍待測。

1.5 產物分析

利用高效液相色譜儀（Waters，e2695，美國）對酶水解后葡萄糖、木糖進行測定。所用分析柱為Bio-Rad Amines HPX-87H 色譜柱，柱溫箱為50℃，檢測器為示差折光檢測器，檢測器溫度為35℃，流動相為5 mmol/L硫酸水溶液，流速為0.6 mL/min。采用外標法定量。

葡萄糖和木糖的產率計算公式如式(4)和式(5)所示。

1.6 離子液體成本分析

乙醇胺和乙酸為大宗化學品試劑，根據阿里巴巴網上價格分別約為2000 美元/t 和600 美元/t。采用Chen 等人[18]報道的方程估算離子液體成本，如式(6)所示。

式中，P 為離子液體價格；M1和M2分別為乙醇胺和乙酸的相對分子質量；P1和P2分別為乙醇胺和乙酸的價格；經計算離子液體[EOA][OAc]的價格為1300美元/t。

1.7 離子液體[EOA][OAc]熱穩定性分析

離子液體[EOA][OAc]熱穩定性由同步熱分析儀（NETZSCH，STA449 F3，德國）測量，測量范圍30～600℃，使用N2作為載氣，升溫速率10℃/min。

圖1 為離子液體[EOA][OAc]的熱穩定檢測圖。由圖1 可知，在溫度140℃下，離子液體[EOA][OAc]質量損失8.46%，溫度達到160℃時，離子液體[EOA][OAc]質量損失19.46%，因此預處理溫度在140℃較為合適。

圖1 離子液體[EOA][OAc]熱穩定檢測圖

2 結果與討論

2.1 不同類型離子液體預處理奇崗草的組分分析

為脫除奇崗草中的木素組分，合成了3 種醇胺類離子液體乙醇胺醋酸鹽（[EOA][OAc]）、二乙醇胺醋酸鹽（[DEOA][OAc]）和三乙醇胺醋酸鹽（[TEOA][OAc]），并與1-丁基-3-甲基咪唑醋酸鹽（[BMIM][OAc]）和1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽（[BMIM][Cl]）共5種離子液體分別處理奇崗草。取奇崗草原料1.5 g，按固液比1∶10 加入離子液體，探討了不同離子液體預處理奇崗草的組分分析，實驗結果見表2。

表2 不同離子液體預處理奇崗草的組分分析* %

如表2 所示，經不同離子液體預處理后，奇崗草的固體殘渣率不同，說明不同離子液體對奇崗草組分溶解度不同。未經預處理奇崗草中，聚葡萄糖和聚木糖含量分別為37.99%和17.41%，Klason木素含量為16.79%。經不同離子液體預處理后，奇崗草固體殘渣中聚葡萄糖和聚木糖相對含量發生了不同變化，木素含量降低，聚葡萄糖含量升高，聚木糖含量有高有低，可見不同離子液體對不同組分具有選擇溶解性[19]。由表2 中數據可知，離子液體[EOA][OAc]處理奇崗草木素脫除率達到76.67%，預處理后聚葡萄糖含量和聚木糖含量分別由為未處理前的37.99%和17.41%升到52.49%和20.73%，Klason 木素含量由16.79%下降到7.69%。纖維素與半纖維素相對含量的增加主要源于木素的大量脫除，這說明離子液體[EOA][OAc]更傾向于溶解木素[14]。因此，[EOA][OAc]為較優預處理離子液體。

2.2 [EOA][OAC]預處理過程因素對奇崗草組分含量的影響

2.2.1 反應溫度和反應時間

取絕干奇崗草粉1.5 g，按照固液比1∶10 加入離子液體[EOA][OAc]，改變反應溫度和反應時間，探討了不同反應溫度（120、140、160℃）下不同反應時間對奇崗草固體殘渣率和組分脫除率的影響，結果見圖2。

圖2 反應溫度和反應時間對奇崗草固體殘渣率和組分脫除率的影響

由圖2(a)所示，在相同反應時間下，反應溫度由120℃增至160℃時，固體殘渣率逐漸降低；相同反應溫度下，隨著反應時間的增加，固體殘渣率逐漸降低，原因可能是反應條件劇烈時，有更多的聚葡萄糖、聚木糖、木素溶解在離子液體中，進而導致固體殘渣率降低，這些變化可由圖2(c)、圖2(d)中得到證實。由圖2(c)、圖2(d)可知，聚木糖脫除率（損失率）高于聚葡萄糖脫除率（損失率），原因可能是離子液體[EOA][OAc]會選擇性溶解木素，與木素連接的碳水化合物（主要是聚木糖）也會隨之脫除。

由圖2(b)可知，當反應時間不變，反應溫度增加時，木素脫除率升高；當反應溫度不變，反應時間增加時，木素脫除率明顯增加；原因可能是隨著溫度升高，離子液體黏度降低，促進了離子液體與原料的反應，促使更多木素溶出，但當反應時間足夠時，離子液體溶解木素溶液趨向于飽和，木素脫除率趨于平緩。Yu 等人[20]使用氨和過氧化氫在150℃下預處理奇崗草，木素脫除率為71.6%。而使用離子液體[EOA][OAc]在140℃下預處理奇崗草5 h 后，木素脫除率達到76.67%。基于木素脫除率的評價，本實驗較優預處理條件為140℃和5 h。

2.2.2 離子液體中水分含量

取絕干奇崗草粉1.5 g，按照固液比1∶10 加入離子液體[EOA][OAc]（140℃，5 h）。改變離子液體中的水分含量，探討水分含量對奇崗草固體殘渣率和組分脫除率的影響，結果見圖3。

由圖3 可知，當離子液體水分含量由0 增加至15%時，固體殘渣率逐漸升高，木素脫除率由76.67%下降至65.36%，原因可能是水分增加可以導致[EOA][OAc]與木素結合能力降低，因此固體殘渣率升高，木素脫除率降低。據文獻[21]報道，離子液體中少量的水分含量對木素的溶解影響不大，但過量的水會破壞離子液體的氫鍵結構，使得離子液體的周圍被水包圍，進而影響木素與離子液體之間的相互作用，導致木素溶解度下降。

當離子液體水分含量逐漸增加，聚葡萄糖的脫除率逐漸降低，水分含量由0增加至15%時，聚葡萄糖脫除率由11.98%下降到6.84%，原因是水分含量的增多降低了離子液體與纖維素氫鍵結合能力；當離子液體水分含量從0 增加到2%時，聚木糖脫除率有少量升高，原因是少量的水分與離子液體陰離子形成氫鍵，游離陽離子濃度增加，增大了對聚木糖的溶解能力，而水分含量超過一定量（2%），就會減弱離子液體中陽離子對聚木糖的溶解能力，導致聚木糖脫除率逐漸降低。呂本蓮[22]研究了離子液體中水分含量對聚木糖的溶解度變化，也得到了相同結論。以木素脫除率的角度看，較適合的離子液體水分含量仍為0。

2.2.3 固液比

取絕干奇崗草粉1.5 g，加入不同固液比離子液體[EOA][OAc]（140℃，5 h），探討不同固液比對奇崗草固體殘渣率和組分脫除率的影響，結果見圖4。從圖4可以看出，隨著固液比的減小，固體殘渣率逐漸降低后趨于穩定，聚葡萄糖、聚木糖脫除率逐漸增加，固液比從1∶5減小到1∶25，聚葡萄糖和聚木糖的脫除率分別從7.33%和21.77%提高到15.28%和28.03%。

固液比從1∶5 減小到1∶25，木素脫除率先從75.88%上升后逐漸穩定在80.84%，原因是固液比越小，單位質量的原料與更多體積的離子液體接觸，增大了離子液體對原料的可及性，而固液比繼續變小，離子液體對原料的反應效果趨于穩定，故脫木素效果趨于穩定。當固液比為1∶10 時，木素脫除率達到76.67%，固體殘渣率已趨于穩定（63.14%），因此，較適宜的固液比為1∶10。

圖3 離子液體中水分含量對奇崗草固體殘渣率和組分脫除率的影響

圖4 固液比對奇崗草固體殘渣率和組分脫除率的影響

圖5 預處理前后奇崗草的XRD圖

2.3 奇崗草的結晶度分析

因為纖維素材料具有結晶區和無定型區[23]，所以測定結晶度是了解纖維素材料的重要途徑。圖5所示為離子液體[EOA][OAc]預處理前后奇崗草的XRD圖。

從圖5 可以看出，奇崗草預處理前后在衍射圖上顯示出峰值在15°≤2θ≤20°和20°≤2θ≤25°，前者是纖維素無定形區引起的吸收峰，后者是纖維素結晶區引起的吸收峰。奇崗草結晶度指數（CrI）計算結果為：預處理前CrI 為49.10%，預處理后的CrI 為44.94%，CrI降低了4.16個百分點，有利于酶水解反應。

2.4 奇崗草的紅外光譜分析

為了解離子液體預處理后固體殘渣的組分變化，將經過離子液體[EOA][OAc]預處理前后的奇崗草進行FT-IR分析，結果見圖6。

圖6 預處理前后奇崗草的FT-IR圖

由圖6 所示，兩條曲線出現的吸收峰基本一致，吸收峰強度略有不同。3429 cm-1處為羥基吸收峰。1729 cm-1附近的吸收峰歸屬于乙酰基中的C＝O 吸收振動，1041 cm-1處屬于半纖維素吸收峰，在木質纖維原料中主要來源于聚木糖吸收，兩條曲線中半纖維素的吸收峰都存在，且預處理后強度略高，說明預處理后半纖維素含量有所提高。1631、1515、1422 cm-1處是芳香族骨架吸收振動，即來源于木素。離子液體預處理后的FT-IR 圖仍然有木素的特征吸收峰，說明預處理后奇崗草中仍然有木素。898 cm-1是碳水化合物中β-1,4 糖苷鍵連接的吸收[23]，本實驗奇崗草經離子液體[EOA][OAc]預處理后898 cm-1處吸收峰值更高，說明預處理后聚葡萄糖含量提高。

2.5 奇崗草的表面形貌分析

圖7 為離子液體[EOA][OAc]預處理前后奇崗草的表面形貌變化。由圖7可知，預處理前的奇崗草結構緊密，纖維表面較為平整，與酶接觸位點有限。經離子液體[EOA][OAc]預處理后，奇崗草纖維表面出現凹凸不平，利于酶水解。離子液體預處理后酶水解效率大大提高（見圖8），原因可能是木素的大量去除增加了纖維的可及性，促進了酶水解效率。

圖7 預處理前后奇崗草的表面形貌變化

2.6 奇崗草的酶解

利用離子液體[EOA][OAc]預處理脫出木素的目的是降低奇崗草原料結構的頑抗性，增加纖維素酶對纖維素的可及度，從而提高酶解效率。因此，選取2個有代表性的預處理后樣品與未預處理奇崗草原料進行酶水解測試，來評估離子液體[EOA][OAc]預處理奇崗草的效果。具體的酶解產率見圖8。

由圖8(a)可知，隨著酶水解時間的增加，葡萄糖產率逐漸增加，原因可能是木素的大量去除，增大了纖維素的可及度。由圖8(b)可知，酶水解時間越長，木糖產率越高。Yu 等人[20]使用氨和過氧化氫預處理奇崗草，酶水解96 h 時，分別將90.2%纖維素、73.4%半纖維素轉化為葡萄糖和木糖。而使用離子液體[EOA][OAc]預處理奇崗草，酶水解72 h時，未經預處理的奇崗草葡萄糖和木糖產率分別為15.97%和6.15%，經140℃下5 h離子液體預處理后奇崗草的葡萄糖和木糖產率分別為85.78%和79.78%，預處理后葡萄糖和木糖產率分別是預處理前的5.37和12.97倍，顯著提高了奇崗草的酶解效率。

2.7 離子液體的循環使用

為了進一步降低離子液體使用成本，對離子液體[EOA][OAc]做了循環使用實驗，實驗結果見表3。

由表3 可知，隨著[EOA][OAc]使用次數的增加，奇崗草固體殘渣率逐漸升高，原因是離子液體[EOA][OAc]使用次數增加后其溶解木素的能力有所降低；同樣奇崗草木素脫除率也隨著使用次數的增加而降低，當離子液體[EOA][OAc]使用第3 次時，木素脫除率為(62.67±1.99)%，可見[EOA][OAc]重復使用3 次后仍有較好的脫木素性能，當離子液體[EOA][OAc]使用第5 次時，木素脫除率為(48.46±2.01)%，這說明[EOA][OAc]具有良好循環使用性能。且[EOA][OAc]的價格為1300 美元/t，其價格與大宗化學品價格接近，經濟可行性較好。

圖8 預處理前后奇崗草葡萄糖和木糖的酶解產率

表3 離子液體循環使用后固體殘渣的組分分析

3 結 論

本研究以奇崗草為原料，探討了不同工藝條件下離子液體對奇崗草木素的脫除率，并利用紅外光譜、X 射線衍射和掃描電子顯微鏡分析了醇胺類離子液體預處理后奇崗草的官能團、結晶度和微觀形貌的變化。

3.1 利用乙醇胺醋酸鹽（[EOA][OAc]）、二乙醇胺醋酸鹽（[DEOA][OAc]）、三乙醇胺醋酸鹽（[TEOA][OAc]）、1-丁基-3-甲基咪唑醋酸鹽（[BMIM][OAc]）和1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽（[BMIM][Cl]）共5 種離子液體對奇崗草進行預處理，基于木素脫除效果比較，離子液體乙醇胺醋酸鹽（[EOA][OAc]）的預處理效果最佳，其對奇崗草木素的脫除率最高。

3.2 離子液體[EOA][OAc]預處理較優條件為：反應溫度140℃、反應時間5 h 和固液比1∶10，此條件下的木素脫除率為76.67%。

3.3 經離子液體[EOA][OAc]預處理的奇崗草進行酶水解72 h 后，葡萄糖和木糖產率分別為85.78%和79.78%，是未經預處理奇崗草酶水解后葡萄糖和木糖產率的5.37倍和12.97倍，預處理顯著提高了奇崗草的酶解效率。

3.4 經[EOA][OAc]預處理后奇崗草的表面結構疏松，纖維素含量增加，晶型不變，結晶度降低。

3.5 離子液體[EOA][OAc]循環使用性能良好，當離子液體[EOA][OAc]循環使用第5 次后，其木素脫除率為(48.46±2.01)%。