不同濃度黃芪提取物對高糖損傷HUVECs的保護機制

袁秀芝，唐 靜，蘇 瓊

(華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院 藥劑科，湖北 武漢 430077)

糖尿病是一類復雜代謝性疾病。我國是糖尿病大國，預計到2035年，中國的糖尿病患病人數將達到1.43億[1-2]。糖尿病血管病變是糖尿病主要的并發癥之一，也是導致糖尿病病人死亡的主要原因之一。黃芪是常用中藥，研究表明黃芪總黃酮對改善糖尿病糖脂代謝有一定作用，本實驗通過在高糖環境中培養HUVECs細胞，比較了三種不同濃度的黃芪提取物對高糖損傷的HUVECs細胞的保護機制，并檢測ET-1、eNOS、p-eNOS水平以及mRNA和蛋白量的表達量，為黃芪的臨床應用提供了進一步的證據支撐。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

HUVECs(武漢普諾賽生物科技有限公司)；黃芪總黃酮提取物(自提)；葡萄糖(GLu)購自南京建成生物工程研究所，Trizol試劑購自Aidlab公司，DL2000 DNA Marker購自TAKARA公司，P0013BRIPA裂解液購自碧天云生物技術公司，P0010BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧天云生物技術公司，兔多抗GAPDH購自杭州賢至生物有限公司(批號：AB-P-R 001)，兔多抗ET1購自武漢三鷹生物技術有限公司(批號：12191-1-AP)。

1.2 儀器

R-205型旋轉蒸發儀(瑞士BuChi公司)；Multiskan MK3全自動酶標儀(Thermo scientific)；IX51型OLYMPUS倒置顯微鏡；EDC-810型PCR儀(東勝創新生物科技有限公司)。

1.3 MTT檢測黃芪提取物對HUVECs細胞活力的影響

將HUVECs細胞分為12組：①正常對照組(葡萄糖濃度為5.5 mmol/L)；②高糖損傷組(葡萄糖濃度為30 mmo1/L)(以下簡稱高糖組)；③高滲對照組(5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇)(以下簡稱高滲組)；④黃芪總黃酮組高濃度(2 mg/mL)+高糖(30 mmol/L葡萄糖)(以下簡稱黃酮高)；⑤黃芪總黃酮組中濃度(1 mg/mL)+高糖(30 mmol/L葡萄糖)(以下簡稱黃酮中)；⑥黃芪總黃酮組低濃度(0.5 mg/mL)+高糖(30 mmol/L葡萄糖)(以下簡稱黃酮低)；⑦黃芪總多糖組高濃度(400 μg/mL)+高糖(30 mmol/L葡萄糖)(以下簡稱多糖高)；⑧黃芪總多糖組中濃度(200 μg/mL)+高糖(30 mmol/L葡萄糖)(以下簡稱多糖中)；⑨黃芪總多糖組低濃度(100 μg/mL)+高糖(30 mmol/L葡萄糖)(以下簡稱多糖低)；⑩黃芪總皂苷組高濃度(400 μg/mL)+高糖(30 mmol/L葡萄糖)(以下簡稱皂苷高)；黃芪總皂苷組中濃度(200 μg/mL)+高糖(30 mmol/L葡萄糖)(以下簡稱皂苷中)；黃芪總皂苷組低濃度(100 μg/mL)+高糖(30 mmol/L葡萄糖)(以下簡稱皂苷低)。各組均在高糖處理前2 h分別加入藥物。取處于對數生長期，生長狀態良好的HUVEC細胞，采用完全培養基調整細胞密度至3×104/mL，接入96孔板，每孔100 μL細胞懸液，同時設空白組，37 ℃培養過夜(在細胞孔周圍孔內加入100 μL無菌PBS)；按實驗分組處理每孔細胞，加入藥物后分別于培養12 h、24 h、48 h后吸出培養基，加入150 μL DMSO震蕩10 min；采用酶標儀測定各孔吸光值OD。

1.4 PCR檢測黃芪提取物對高糖誘導培養的HUVECs中ET-1、eNOS的mRNA表達

采用Trizol法提取RNA后，逆轉錄成cDNA，設計相應的引物(表1)，采用實時熒光定量PCR檢測，測定HUVECs細胞內ET-1的表達。以空白組數據2-ΔΔCt作為一個基準點，作為1，再將各組數據中各個點的數值和基準點比較，得到數據[3](見圖4)。

表1 PCR引物序列

1.5 黃芪提取物對高糖誘導培養的HUVECs中總ET-1和p-eNOS蛋白表達的影響

倒掉培養液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養液，加入4 ℃預冷的PBS液洗滌細胞加入裂解液，充分裂解后，12 000 rpm離心5 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度，-20 ℃凍存備用。30%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品，用1×TBS漂洗一次，加入含5%脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜，室溫搖床封閉2h，分別加入一抗，4 ℃過夜，洗膜后分別加入HRP標記二抗，37 ℃搖床孵育2 h，用TBST充分洗滌PVDF膜；加入增強化學發光試劑(ECL)后置于曝光機上曝光，用BandScan分析膠片灰度值，以目的條帶和GAPDH條帶灰度值比值作為最終結果。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 MTT檢測黃芪提取物對HUVECs細胞活力的影響

表2 黃芪提取物對HUVECs細胞活力的抑制率(%)

以實驗各組與空白對照組OD的比值作為細胞活力抑制率，通過對HUVECs細胞活力抑制率的考察發現，高糖組會顯著影響HUVECs細胞的活力，自給藥后12 h起，黃芪提取物各組就能對高糖引起的HUVECs細胞損傷產生一定的保護作用(P<0.05))；隨著培養時間的延長，黃芪提取物各組對高糖損傷的保護作用不斷增強(P<0.05)，這說明不同濃度的黃芪提取物均能保護HUVECs細胞，并呈現出一定程度的濃度相關性，其中以高劑量黃芪提取物組對HUVECs細胞的保護作用最為明顯(P<0.05)。

2.2 PCR檢測黃芪提取物對高糖誘導培養的HUVECs中ET-1、eNOS的mRNA表達

圖1 ET-1的mRNA的表達

圖2 eNOS的mRNA表達

由圖1可以看出，與正常相比，高糖組ET-1的表達明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)，經過高、中、低濃度黃芪提取物干預后，ET-1的表達受到了一定程度的抑制；從上圖還可以看出，黃芪提取物對HUVECs高糖損傷保護作用呈一定的濃度相關性，且高濃度黃芪提取物(黃酮高、多糖高、皂苷高)組能明顯抑制ET-1的表達，說明高濃度黃芪提取物組對細胞的保護作用最強。

由圖2可以看出，與正常組相比，高糖組eNOS的表達出現了明顯下降，經過高、中、低濃度黃芪提取物干預后eNOS的表達量增加；高濃度提取物(黃酮高、多糖高、皂苷高)組與低濃度組相比，eNOS值增加最明顯，這也說明高濃度組對細胞的保護作用最強。

2.3 Western blot法檢測黃芪提取物對高糖誘導培養的HUVECs中總ET-1和p-eNOS蛋白表達的影響

圖3 GAPDH蛋白表達

圖4 ET-1蛋白表達

圖5 eNOS蛋白表達

圖6 p-eNOS蛋白表達

表2 ET1/GAPDH、eNOS/GAPDH與p-eNOS/GAPDH灰度值比值

由表2可知，各組間 ET-l蛋白表達差異具有統計學意義(P<0.05)。與正常對照組相比，高糖損傷組ET-1蛋白表達量出現明顯升高(P<0.05)；而與高糖損傷組比較，三種黃芪提取物各濃度組均可抑制高糖所致的ET-1蛋白表達升高，且呈濃度相關性(P<0.05)，以高劑量提取物組作用最為明顯(P<0.05)。

表2中，與正常組相比，高糖因素對eNOS蛋白的表達影響不明顯(P>0.05)；黃芪提取物干預后，e-NOS蛋白表達也不顯著(P>0.05)。結果提示，高糖、黃芪提取物對e-NOS蛋白表達基本無影響。

由表2可以看出，各組間 p-eNOS蛋白表達差異有統計學意義(P<0.05)，與正常對照組相比，高糖損傷組 p-e NOS蛋白表達較正常對照組明顯下降(P<0.05)，通過三種不同濃度的黃芪提取物干預后，各組 p-eNOS蛋白的表達量明顯增加，且在一定程度上呈現出濃度依賴的特點。這說明，黃芪提取物呈濃度依賴地促進高糖HUVECs中的e NOS磷酸化激活。

3 討論

黃芪的降糖療效比較確切，對其降糖機制的研究能更好地指導臨床合理用藥。本研究通過HUVEC細胞建立高糖損傷模型，采用黃芪中三種主要有效成分進行干預，從細胞學的角度，分析黃芪三種有效成分對HUVEC保護作用的機制。

近年來研究[6-7]表明，ET-1濃度與動脈粥樣硬化和血管重構有關。ET-1是內皮細胞分泌的最有效的血管收縮因子，對血管具有強烈的收縮作用，ET-1分泌量增多會造成血管痙攣，引起血管平滑肌細胞增殖，導致血小板黏附、聚集，促進血栓形成[8]。本研究證實，高糖組基因表達HUVEC中ET-1基因的表達水平明顯高于正常組，eNOS基因表達顯著低于正常組，這說明高糖會增加心血管疾病事件的發生率；黃芪提取物的干預改善了高糖HUVEC中ET-1、eNOS基因的表達。

黃芪提取物改善高糖引起的血管內皮功能的機制較為復雜。p-eNOS作為血管中的一種保護蛋白，通過NO的產生減輕血流動力學壓力，從而保護動脈壁免受損傷。本研究發現高糖可加重血管內皮的損傷，高糖會降低eNOS的活性，從而降低NO的生物利用度，所有這些過程都會對HUVEC產生影響，最終導致血管舒張功能下降和內皮功能障礙；黃芪提取物可顯著增加p-eNOS的表達，保護了HUVEC，改善了血管內皮功能，降低了血管疾病的發生率。

NO由內皮NO合酶(eNOS)產生，其能自由地進入血管平滑肌細胞，是影響血管內皮功能的重要舒張因子。ET-1除了對傳統的PI3K-Akt-eNOS、p38MAPK[9-11]通路產生影響外，還能激活RhoA，使NO介導的RhoA/Rock通路失活，且該通路會對血管和組織內皮的通透性產生重要影響。

綜上所述，本研究從ET-1、eNOS、p-eNOS角度初步探明了黃芪提取物對高糖所致HUVECs的保護機制，但本研究的證據存在一定局限性，有待進一步從信號通路方面對其保護機制進行深入挖掘。