基于高效高壓差低溫連續式提取技術的五指毛桃提取工藝研究

劉常青，黃偉明，王旭龍，宋力飛，馬志鵬

(廣州澤力醫藥科技有限公司，廣東 廣州 510663)

五指毛桃，別名五指牛奶、土黃芪，為?？浦参锎秩~榕(FicushirtaVahl.)干燥后的根，是華南地區煲湯保健常用藥食兩用中藥材，具有健脾利濕、益肺止咳、舒筋通絡的功效，常用于脾虛浮腫、食少無力、肝炎、風濕痹痛、肺癆咳嗽等癥的治療[1-3]。現代研究表明，五指毛桃含有豐富的多糖、生物堿、香豆素、黃酮等活性物質，其中五指毛桃的主要有效成分為香豆素類化合物——補骨脂素，具有消炎、抗病毒、抑制腫瘤、抗凝、免疫調節和影響藥物代謝等作用[4-7]。目前文獻報道的五指毛桃中補骨脂素的提取溶劑多為有機溶劑，方法各不相同，如甲醇冷浸提取法、三氯甲烷水浴回流提取法、乙醇超聲提取法、甲醇超聲提取法等[8-12]。有機溶劑易殘留，造成安全隱患。本研究首次運用高效高壓差低溫連續式提取分離濃縮技術及成套裝備對五指毛桃進行提取，并以五指毛桃中主要有效成分補骨脂素的提取率為指標，對工藝參數進行優化，對五指毛桃提取物的規?；崛√峁┮欢ǖ募夹g支持與理論指導。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

五指毛桃(玉林市弘健中藥材有限公司)；補骨脂素對照品(批號：190113，純度：≥99%)；甲醇(分析純)；乙腈(色譜純)。

1.2 儀器與設備

高效高壓差低溫連續式提取分離濃縮技術及成套裝備(廣州澤力醫藥科技有限公司)；Agilent 1100高效液相色譜儀(Agilent公司)；KQ-300VDE型雙頻數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2 方法與結果

2.1 工藝流程

五指毛桃提取工藝流程：粉碎→高壓差提取→離心(取清液)→微濾(取清液)→反滲透(取濃液)→真空濃縮→五指毛桃提取物。

2.2 補骨脂素含量的測定

2.2.1 供試品制備 將五指毛桃粉碎，精密稱取五指毛桃細碎品1 g，加入10 mL甲醇，超聲(功率100 W，頻率40 kHz)提取30 min(水溫升高約1 ℃)，冷卻至室溫后用甲醇補足失質量，搖勻，濾過，濾過液用0.45 μm微孔濾膜(有機)過濾，取續濾液作為供試品溶液，備用。

2.2.2 色譜條件 色譜柱：DIKMA Platisil ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：55%乙腈(B)-水，運行時間：15 min，檢測波長：246 nm，柱溫：30 ℃，流速：1.0 mL/min，進樣體積：20 μL。

2.2.3 標準曲線的繪制 精密稱取補骨脂素對照品10 mg，加甲醇溶解定容至10 mL。分別精密吸取對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，用甲醇稀釋配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的標準溶液，在“2.2.2”項色譜條件下進樣，以濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線并進行線性回歸，得回歸方程為：Y=136221X+752.5，R2=0.999 4。結果表明，補骨脂素在0.1～0.5 mg/mL濃度范圍內與其峰面積積分線性關系良好。

2.2.4 精密度試驗 精密吸取0.03 mg/mL對照品溶液及供試品溶液，分別按照“2.2.2”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積，結果對照品溶液峰面積的RSD為0.68%，供試品溶液RSD為1.97%。

2.2.5 重復性試驗 取同一批次五指毛桃藥材6份，每份1 g，按照“2.2.1”項下方法對供試品溶液進行制備，分別進樣測定補骨脂素的峰面積，結果RSD為1.83%。

2.2.6 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、12、24、48 h進樣測定，進樣量20 μL，分別記錄補骨脂素的峰面積，平均峰面積為30 587.52，RSD為1.32%，供試品溶液在48 h內穩定。

2.2.7 加樣回收試驗 精密稱取已知補骨脂素含量為0.22 mg/g的供試品6份，每份約0.5 g，依次加入濃度為0.01 mg/mL的對照品溶液10 mL，按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，分別進樣測定，記錄峰面積。補骨脂素平均回收率為101.27%，RSD為1.41%。

2.3 提取率的計算

2.4 單因素試驗

以水為溶劑，通過高效高壓差低溫連續式提取技術對五指毛桃進行提取，以五指毛桃功效成分補骨脂素的提取率為評價指標，選擇提取次數、提取料液比、提取壓力三個因素進行單因素試驗，考查其對五指毛桃中補骨脂素提取率的影響。

2.4.1 提取次數對提取率的影響 固定提取料液比為1∶15，提取壓力為30 MPa，考察提取次數為1、2、3、4、5次條件下對補骨脂素提取率的影響，結果見圖1。

圖1 提取次數對提取率的影響

由圖1可知，提取次數在2～5次時提取率逐漸提高，在提取2次時出現明顯拐點，但在提取3次后提取率變化不明顯，綜合能耗、提取效率、濃縮效率等方面考量，將提取次數確定為2次。

2.4.2 提取料液比對提取率的影響 固定提取次數為2次，提取壓力為30 MPa，分別在提取料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30條件下進行試驗，考察提取料液比對五指毛桃中補骨脂素提取率的影響，結果見圖2。

圖2 提取料液比對提取率的影響

隨著提取料液比的增大，提取率呈不斷增大趨勢，當料液比為1∶20時，五指毛桃中補骨脂素提取率出現明顯拐點，當料液比進一步增大時，提取率趨勢變得平緩。因此，確定料液比為1∶20。

2.4.3 提取壓力對提取率的影響 固定提取次數為2次，提取料液比為1∶20，分別在提取壓力為20 MPa、25 MPa、30 MPa、35 MPa、40 MPa條件下進行試驗，考查提取壓力對五指毛桃中補骨脂素提取率的影響，結果見圖3。

圖3 提取壓力對提取率的影響

從圖3可以看出，隨著提取壓力的不斷增大，五指毛桃中補骨脂素的提取率呈增加趨勢，當提取壓力為30 MPa時，隨著提取壓力的增加，提取率增加效果不明顯，30 MPa提高至40 MPa時，提取率變化幅度約為1%，由于較高的提取壓力對提取設備的磨損較大，綜合實際因素考量，確定提取壓力為30 MPa。

2.5 正交試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上，以五指毛桃中補骨脂素的提取率為評價指標，選取提取次數、料液比、提取壓力三個因素進行正交試驗，對提取工藝條件進行優化，因素水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平

2.6 五指毛桃提取工藝優化

五指毛桃提取工藝優化正交試驗結果及方差分析見表2、表3。影響五指毛桃補骨脂素提取率的因素主次順序為A(提取次數)>C(提取壓力)>B(料液比)，最佳工藝條件為A3B2C3，即：提取次數為3次，料液比為1∶20，提取壓力為35Mpa。此試驗條件在正交表中并未出現，通過補充試驗驗證，得到補骨脂素的提取率為82.27%，大于正交試驗結果中出現的最高值，說明利用正交試驗對五指毛桃提取工藝進行優化是有效的。

表2 正交試驗設計與結果

表3 方差分析

2.7 驗證試驗

在最優工藝條件下，即提取次數為3次，提取料液比為1∶20，提取壓力為35Mpa，進行3次驗證試驗，得到補骨脂素的平均提取率為81.38%，說明基于高效高壓差低溫連續式提取技術的五指毛桃提取工藝優化結果可靠性良好。

3 討論

本研究以水為溶劑，基于高效高壓差低溫連續式提取技術對五指毛桃提取工藝進行了優化，結果表明，在提取次數為3次，料液比為1∶20，提取壓力為35 Mpa的條件下，提取率達82.27%。五指毛桃為華南地區煲湯保健常見藥食兩用中藥材，具有健脾利濕、益肺止咳、舒筋通絡的功效。以水為溶劑對五指毛桃進行提取，提取物不存在有機溶劑殘留的隱患，在功能性食品中添加具有很大優勢，為五指毛桃產品的開發提供了參考，為基于高效高壓差低溫連續式提取技術的五指毛桃提取規?；a提供了理論指導。