L型細菌與抗生素耐藥

劉 薔， 楊 萍， 盧 明， 陳代杰

L型細菌是一種細菌細胞壁形成受到抑制的特殊生長形式，可在體內自發形成。本綜述主要闡述L型細菌與感染及其耐藥機制。

1 L型細菌與感染

L型細菌的基本形狀是球形的，但具有高度的可塑性，可在周圍環境的影響下呈現出一系列不規則的形狀。L型細菌在1935年由Klieneberger[1]在研究桿狀革蘭陰性菌莫尼鏈球菌時首次發現，并以其當時工作的李斯特菌研究所（Lister Institute）命名[2]。

許多細菌都能形成L型，如枯草芽孢桿菌、博氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi）[3]等。自20世紀40年代起，L型細菌與一系列傳染病的聯系已有大量研究[4-6]，大多數研究主要集中于泌尿系統、心血管系統和中樞神經系統感染。不少文獻也報道了呼吸道、胃腸道、表皮和生殖系統感染。

人腎髓質呈高滲生理環境[7]。此外，在泌尿系統細菌感染的患者中，尿液的滲透壓通常高于健康人[8]。因此，許多研究集中于L型細菌在復發性尿路感染（urinary tract infection， rUTI）中的重要性及導致疾病的可能性。

根據L型細菌可通過0.45 mm濾過器，而有壁細菌無法濾過的原理，研究者可從尿液或腎臟中分離出兩種L型細菌，將過濾后的樣品接種于有或無滲透保護的培養基中，并進行長時間的培養。采用這種方法，20世紀60年代的研究者們從泌尿系統感染患者中成功分離出L型細菌[9-12]。

Domingue[4]綜述了20世紀60－80年代一系列的研究，這些研究通過顯微鏡方法對患有腎臟疾病和尿路感染患者的尿液和血液中的細菌結構進行了檢測。利用人類胚胎腎成纖維細胞（HEK）和感染大腸埃希菌、奇異變形桿菌或大腸埃希菌L型的無菌動物，研究L型細菌在宿主組織中的存活能力，提出宿主細胞中小的、電子密度高的、非泡狀的形式是細菌持留性的關鍵所在。Wittler等[13]在使用抗生素治療的亞急性心內膜炎患者的血液中也檢測到小顆粒狀的形式。顆粒在滲透保護介質中呈L型生長，隨后又回復到有壁桿菌。Almenoff等[14]從20例結節病患者中19例的血液標本中分離出L型結核分枝桿菌，而健康對照組的血液中沒有生長。對慢性葡萄球菌感染、布魯菌病以及A群鏈球菌引起的風濕熱患者進行了相似的研究 [15- 19]。

20世紀早期的科學研究表明，引起rUTI的細菌可以通過采取細胞壁缺陷型或L型狀態幸存于細胞壁特異性抗生素的治療中。但由于缺乏分子診斷工具，這些研究難以令人信服[20]。而且，由于常規的微生物培養基是低滲的，并且不支持L型生長，因此L型細菌在臨床中幾乎被完全忽略。近期Mickiewicz等[21]發現在30例rUTI老年患者中29例的新鮮尿液中存在L型細菌。從rUTI患者中分離出的L 型細菌可以在有磷霉素的情況下在尿液中存活，并且在停用抗生素后能夠再生其細胞壁。同樣在斑馬魚幼蟲感染模型中也能發現同樣的轉換。Rojas等[22]發現，革蘭陰性細菌外膜對細胞的機械穩定性起了重要作用，這也許可以解釋為何L型細菌可在尿液中存活。

Beaman等[23-28]報道L型諾卡菌在疾病中可能的作用，發現在一個小鼠模型中的L型諾卡菌是從有壁細菌轉變而來。L型參與了持留性以及慢性肌瘤特征性顆粒的發展。有趣的是，L型細菌僅在免疫功能強的小鼠身上觀察到，而免疫系統不全（無脾無胸腺）的小鼠則不能檢測到，這表明體內免疫系統對L型細菌有誘導作用。此外，他們成功地使用滲透保護型培養基從1例后來死于腦膿腫患者的腦脊液中分離出了多個L型細菌。且重要的是在無滲透保護的情況下培養時，并沒有觀察到任何細菌生長，提示L型是患者腦脊液中諾卡菌的主要或唯一的變異。其他研究也在尋找L型細菌與中樞神經系統慢性感染之間的聯系，但結果并沒有定 論。

Zhang等[29]對62例合并糖尿病的結核病痰涂片陽性患者和89例非糖尿病結核病患者進行回顧性分析，發現在這62例研究對象中，46.77%結核分枝桿菌L（MTB-L）型呈陽性。糖尿病合并肺結核患者的耐藥性明顯高于單純肺結核患者，因此在確定結核病治愈的細菌學證據時，應更嚴格地測試MTB-L型涂片染色檢查。

Akimoto等[30]在結節病患者Hamazaki-Wesenberg淋巴結中檢測到L型痤瘡丙酸桿菌。這可能是首次在結節病組織中證實的痤瘡丙酸桿菌L型感染病例報告，結節病組織發展為孤立性肉芽腫性厚腦膜炎。該研究提示，用PCR方法定量檢測血液或腦脊液中痤瘡丙酸桿菌的DNA有助于孤立性神經瘤樣病變的診斷，而用抗生素二甲胺四環素和強力霉素治療是有效的。

L型細菌雖然與許多感染相關，但Schnell等[31]發現雖然未激活的巨噬細胞會使L型李斯特菌持留，但可以通過預激活干擾素（IFN）-γ或骨髓來源的巨噬細胞（BMM）有效地消除細菌。缺乏IFN-β觸發表明L型細菌無法從巨噬細胞逃逸到細胞質中。這些結果表明由于毒力因子的表達減少和先天免疫識別，L型李斯特菌的致病性會大大減 弱。

2 L型細菌的耐藥機制

2.1 L型細菌表面結構的改變與抗生素耐受

在體外，L型細菌形成困難，會因為產生活性氧（ROS）而致死。Kawai等[32]進一步研究發現L型細菌的轉化與中心碳代謝相關。缺乏細胞壁或用β內酰胺類抗生素阻止其合成，會導致糖酵解的通量增加，導致呼吸鏈中產生活性氧，阻止了L型細菌的生長。通過減慢糖酵解，激活糖異生或消耗氧氣來補償代謝失衡，可使L型枯草芽孢桿菌、單核細胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌生長，而這些作用在缺乏呼吸鏈途徑的糞腸球菌中則不會發生。

L型細菌細胞壁的缺失會使其對細胞壁靶向藥物產生耐藥性。事實上，細胞壁靶向抗生素甚至促進了有壁細胞向L型細菌的轉變[32]。例如，在滲透壓平衡的條件下，大多數革蘭陰性細菌中通常可以防止β內酰胺類抗生素引發的災難性鼓脹和細胞死亡，這些細菌傾向于失去其肽聚糖層，因此采用球形形態，即原生質球形態[33-34]。原生質球由于承受壓力的外膜而保持完整[22，35]。研究顯示，在包括銅綠假單胞菌、霍亂弧菌、陰溝腸桿菌和克雷伯菌在內的一系列致病菌中都觀察到了這一現象[33-34]。用美羅培南（5 MIC）處理銅綠假單胞菌PA14菌株后，Monahan等[33]發現整個種群從正常桿狀細胞迅速轉變為明顯的球形細胞，在24 h內整個種群僅由球形細胞組成。在標準培養基（MH培養基）及與感染和體內環境有關的條件（合成痰液和胎牛血清）下，均能觀察到此現象。用透射電鏡（TEM）觀察到球形細胞的細胞壁被破壞，表明當用靶向細胞壁的抗生素攻擊時，銅綠假單胞菌可以轉化為L型，且此過程為可逆過程，去除抗生素壓力后，L型可轉變為原來的有壁細胞狀態。

Slavchev等[36]在體外通過低溫應激處理產生MTB-L型。低溫脅迫處理后，使用Canetti絕對濃縮法對表型進行評估，評估了親本菌株及其L型培養物對乙胺丁醇的敏感性，并通過PCR-RFLP分析針對embB306基因突變的分段。與對乙胺丁醇（2 mg/L）敏感的親本菌株相比，其L型表現出對高濃度乙胺丁醇（16 mg / L）的抗性。值得注意的是，在L型變異體中未發現embB306突變。此外，通過擴增和測序16S rRNA基因片段，親本菌株和L型均無遺傳差異。在測試的特定位點，L型變異體缺乏遺傳變化，這促使它們通過展示非特異性防御機制和形成L型獨特的形態結構來尋求其對乙胺丁醇的表型耐藥性的解釋。他們觀察到，在壓力下，結核分枝桿菌會發生劇烈的形態和功能變化，導致L型轉化。TEM和掃描電鏡觀察發現壁分離的碎片和無定形物質圍繞著細胞呈膠囊狀物質分布，使球形L體或球狀L型細胞的微菌落位于豐富的生物膜樣基質中。Slavchev等[36]認為結核分枝桿菌對乙胺丁醇的耐藥表型可能與L型細菌細胞壁的改變或丟失有關，從而導致乙胺丁醇對其作用缺乏明確的靶點。L型細菌產生的膠囊狀結構和生物膜基質有助于其在抗菌藥物存在下的耐藥性和存活率。這兩種物質會完全包圍L型細菌，起到屏障的作用來阻止抗生素的滲透。在無法殺死細胞壁缺陷L型細菌的情況下，抗結核治療無效。

2.2 L型細菌表面結構的改變與免疫逃逸

最近的證據已經明確證明革蘭陽性細菌可以在哺乳動物巨噬細胞內的β內酰胺類藥物治療中存活，它們通過轉化為L型來實現，L型是由宿主裂解酶（例如溶菌酶）的活性刺激的過程。這不僅在巨噬細胞中觀察到，而且能在動物模型中觀察到[32]。Kawai等[32]用枯草芽孢桿菌感染蠟螟（Galleria mellonella）的幼蟲（該模型具有先天免疫系統，其中包含與人類巨噬細胞類似的吞噬細胞，是一種使用越來越廣泛的簡單動物模型）時，能觀察到在血淋巴中懸浮著許多球形枯草芽孢桿菌細胞。他們認為幼蟲吞噬細胞會影響細菌細胞狀態，這可能是由于幼蟲產生分解酶的作用而產生的。為了進一步驗證猜想，他們將經過細菌感染的血淋巴涂在含有青霉素G的等滲瓊脂上，對照組為血淋巴相同孵育條件下但無細菌感染。結果如預期，在孵育2 d后，對照組未出現菌落，而實驗組觀察到大量枯草芽孢桿菌的L型菌落，用金黃色葡萄球菌也獲得類似的結果。基于這些結果，研究者認為宿主環境中的免疫效應物（可能包括溶菌酶）可以驅動L型轉變，從而有助于對β 內酰胺類藥物耐受。

細胞壁缺陷細胞的可延展狀態甚至可能通過有壁細胞難以通過的孔洞促進菌體細胞在宿主內的擴散。由于它們缺乏與病原體相關的模式識別受體識別的各種分子，尤其是磷壁酸和肽聚糖[37-38]，因此先天免疫系統不易檢測到細胞壁缺陷形式。因此，細胞壁缺陷也可以使細菌在對壁靶向抗生素不敏感的狀態下逃脫先天免疫殺傷。至關重要的是，在抗生素治療終止后，這些細菌（特別是革蘭陰性細菌）可以有效地恢復到其有壁狀態，并重新導致宿主感染[20，39]。

3 小結

L型細菌是一種細菌細胞壁形成受到抑制的特殊的生長形式，可在體內自發形成。見圖1。隨著分子診斷技術的發展，發現其在rUTI等感染中起著重要作用。由于細胞壁缺失以及隨之帶來的表面抗原減少，L型細菌可逃避壁靶向類抗生素以及巨噬細胞殺傷，產生抗生素耐受以及免疫逃逸現象，給臨床治療帶來不小的挑戰。將靶向細胞壁的抗生素與其他類別的抗生素（例如針對細菌膜的抗生素）組合使用可能是臨床治療細菌感染的新方向。

圖1 L型細菌感染及免疫逃逸與抗生素耐藥關系