霍山石斛內生真菌DHS-3、DHS-4代謝產物的高效液相研究

陳傳平，柯 成，陳乃東

（1.皖西衛生職業學院，安徽 六安 237005；2.皖西學院 生物與制藥工程學院，安徽 六安 237012）

霍山石斛（Dendrobium huoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng），蘭科石斛屬，多年生草本類植物，俗名米斛，主要分布于大別山區[1]。霍山石斛含有多糖、生物堿和黃酮等有效活性成分[2]，具有抗氧化、延緩人體衰老、增強身體免疫力等藥理作用，是安徽省道地珍稀瀕危藥材之一[3]。

近年，野生霍山石斛產量日益減少，資源匱乏，難以滿足市場需求，人工組培石斛雖然彌補了野生石斛的產量不足，但藥效成分相比野生石斛有所差異[4]。根據近幾年的研究，組培獲得的霍山石斛試管苗與野生霍山石斛相比，缺少內生真菌是出現差異成分的重要因素[5]。很多藥用植物的內生真菌的代謝產物與其宿主植物產生的代謝產物相同或類似[6]，內生真菌以及該菌的代謝產物研究已經成為尋找藥物活性成分、保護瀕危藥用植物的重要途徑之一[7]。本實驗以已經分離得到的霍山石斛內生真菌進行培養，運用高效液相色譜（HPLC）檢測技術對霍山石斛內生真菌的代謝產物進行分析，探究霍山石斛內生真菌的代謝產物中是否有與霍山石斛的成分相同的物質，為霍山石斛的資源保護與開發利用提供依據。

1 材料和試劑

1.1 儀器設備

高效液相色譜儀：Lanb4000 HPLC 色譜儀；KQ-300DE 數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-4C數顯恒溫水浴鍋（常州普天儀器制造有限公司）；YGH-500S/BS 遠紅外快速恒溫干燥箱（上海躍進醫療器械有限公司）；CHA-S氣浴恒溫振蕩器（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；FD-1A-50冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）；等。

1.2 試劑和原料

葡萄糖（AR，中國國藥集團有限公司北京分公司），甲醇、乙腈、石油醚（色譜純，阿拉丁公司）。

霍山石斛，2017 年3 月購自安徽省霍山縣霍山石斛栽培基地，由植物細胞工程安徽省工程技術研究中心陳乃富教授鑒定為霍山石斛（DendrobiumhuoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng）；霍山石斛內生真菌DHS-3、DHS-4，由皖西學院生物與制藥工程學院陳乃東教授課題組提供。

2 研究方法

2.1 霍山石斛甲醇提取物的制備

2.1.1 霍山石斛材料處理

新采集的霍山石斛鮮條，純凈水洗凈，剪碎，置70℃烘干箱中烘干至恒重，粉碎，過40 目篩，-80℃冷凍待用。

2.1.2 霍山石斛甲醇提取物的制備

稱取霍山石斛凍干粉1.0g，置100mL 圓底燒瓶中，加入甲醇50mL，80℃冷回流提取3h，重復3 次，合并提取液，減壓濃縮即得霍山石斛甲醇提取物。

2.2 內生真菌次生代謝產物的制備

2.2.1 培養基的制備

制備液體馬鈴薯培養基（PDA）：稱取去皮土豆200.0g，切成塊狀，加入H2O800.0mL，煮沸并維持20min，降溫后用四層紗布將溶液過濾，收集濾液。濾液中逐次加入葡萄糖20.0g、KH2PO43.0g、MgSO4·7H2O1.5g，攪拌均勻移入1000mL 三角燒瓶中，調節pH 至 7.0，定容至 1000mL 后，逐次倒入 34 個 150mL三角燒瓶中（每瓶大約分裝30mL），瓶口添加棉塞，標記，置于高壓蒸汽滅菌鍋內滅菌，冷卻后無菌檢查合格即可待用。

2.2.2 內生真菌的培養

在超凈工作臺中，打開待用PDA 培養基，將挑有DHS-3、DHS-4的接種環在液體表面的瓶內壁上用力震蕩，使菌體分散進入PDA中，所得即為種液；在三角燒瓶上分別標記為DHS-3A、DHS-3B、DHS-4A、DHS-4B，置于搖床中（氣浴恒溫振蕩器、溫度28℃、轉速160-180r/min）活化培養24-48h。

活化培養結束，將三角燒瓶中的培養液用移液器移取1mL 轉接到新的PDA 中，以經相同處理、不接種的培養基為空白對照，同條件培養4-5d 后，-80℃冷凍干燥至恒重，粉碎，過40目篩，待用。

2.2.3 次生代謝產物的制備

稱取DHS-3、DHS-4發酵液凍干粉各1.0g，分別置100mL 圓底燒瓶中，加入甲醇50mL，80℃冷回流提取3h，重復3次，合并提取液，減壓濃縮即得DHS-3、DHS-4甲醇次生代謝產物提取物。

2.3 檢測樣品的制備

樣品用石油醚反復萃取5 次，合并萃取液后70℃揮干，稱取樣品質量，再用甲醇溶解，有機濾頭過濾，收集到樣品瓶內，計算濃度并貼上標簽，待檢測。

2.4 色譜條件

經過反復預實驗，確定色譜條件為：色譜柱：AgilentSB-C18 4.6×150nm，5μm；上樣量：20μL；流速：1mL/min；檢測波長：280nm；柱溫：30℃；流動相：乙腈-0.04%磷酸水溶液[8]。

2.5 數據處理

實驗樣品檢測完畢，應用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A 版”評估軟件，尋找相似的洗脫峰，確定共有峰、保留時間、相似度分析等相關圖譜數據。

2.6 方法學考察

2.6.1 穩定性試驗

每次吸取20μL 同一樣品溶液，每隔6h 進樣一次，共4 次，將所得圖譜通過軟件比對分析，結果如表1所示。

2.6.2 重復性試驗

每次吸取20μL 同一樣品溶液，依次上樣4 次，將所得圖譜通過軟件比對分析，結果如表1所示。

表1 檢測圖相似度數據

3 結 果

3.1 DHS-3圖譜分析

圖1 為DHS-3 與霍山石斛甲醇提取物的HPLC檢測圖譜。

圖1-A為DHS-3與空白對照檢測圖譜，比對后可發現，DHS-3 檢測圖譜上的RT100.47min、RT119.02min時的2個洗脫峰在圖譜上均存在，且峰的分離效果比較好，故在進行DHS-3檢測圖譜與霍山石斛檢測圖譜比對過程中，應該將這2 個洗脫峰去除。

在圖1-B中，將DHS-3檢測圖譜與霍山石斛檢測圖譜對比可以發現，RT18.353min、RT48.536min時的2 個洗脫峰在圖譜上均存在，且峰的分離效果比較好，在與空白對照的過程中也沒發現相應時間段出現洗脫峰，故可確定這2 個峰是DHS-3 的代謝產物與霍山石斛的共有產物。

圖1 DHS-3與霍山石斛HPLC檢測圖譜

3.2 DHS-4圖譜分析

圖2 為DHS-4 與霍山石斛甲醇提取物的HPLC檢測圖譜。

在圖2-A中，將DHS-4檢測圖譜與空白對照圖譜比對后可發現，DHS-4檢測圖譜上RT100.47min、RT119.02min 時的2 個洗脫峰在圖譜上均存在且峰的分離效果比較好，故在進行DHS-4檢測圖譜與霍山石斛檢測圖譜比對過程中，應該將這2 個洗脫峰去除。

在圖2-B中，將DHS-4檢測圖譜與霍山石斛檢測圖譜經過對比可以發現，RT29.442min、RT50.358min時的2個洗脫峰在圖譜上均存在，且峰的分離效果比較好，而且在與空白對照的過程中也沒發現相應時間段出現洗脫峰，故確定這2 個峰是DHS-4的代謝產物與霍山石斛的共有產物。

圖2 DHS-4與霍山石斛HPLC檢測圖譜

3.3 結論

根據霍山石斛內生真菌DHS-3、DHS-4代謝產物的HPLC 檢測圖譜分析可知，洗脫峰RT18.353、RT48.536，RT29.442、RT50.358 分 別 為 DHS- 3、DHS-4 兩種菌的代謝產物與霍山石斛的共有峰。綜上所述，霍山石斛內生真菌DHS-3、DHS-4 可能產生與霍山石斛相同的物質。

4 討 論

植物內生真菌是指其生活史中某一階段或整個階段生活在生長健康的植物組織或細胞內，并對宿主細胞沒有明顯病害狀況的一類真菌[9]。研究表明，植物內生真菌與其宿主在長期進化過程中存在互生互惠的關系，能產生與宿主相同或者相似的化學成分[10]。霍山石斛種子萌發和植株的生長發育都需要依賴與之共生的內生真菌[11]。本實驗采用HPLC 法，對霍山石斛內生真菌 DHS-3 與 DHS-4 發酵產物甲醇提取物進行分析，根據檢測圖譜比對，從內生真菌發酵產物中發現內生真菌源霍山石斛的某些化學成分，為進一步采用真菌發酵而獲得霍山石斛化學成分、降低對原藥材的依賴、保護瀕危藥用植物霍山石斛資源提供可行思路。

本實驗雖然實現了霍山石斛內生真菌發酵產物的較好分離，并在DHS-3、DHS-4 發酵產物中均發現內生真菌源霍山石斛可能的化學成分，但受到目前對霍山石斛及其內生真菌的認知局限，尚并不能確定HPLC 譜中共有組分峰的具體化學成分[12]及該共有峰是否為霍山石斛的主要活性來源[13]，需進行進一步實驗加以深入研究。