蒸汽閃爆處理對高溫米糠粕美拉德反應的影響

那治國 ，王紅梅，閆寶軍，張嵐，馬永強*

1. 黑龍江東方學院食品與環境工程學部（哈爾濱 150066）；2. 哈爾濱商業大學食品工程學院（哈爾濱 150076）

米糠作為水稻制米的主要副產物，資源極其豐富，其中所含蛋白質不僅必需氨基酸組成合理，效價較高，而且具有低過敏性等優點，是一種極具開發潛力的植物蛋白資源[1-3]。然而，由于米糠蛋白溶解性低，提取困難，且蛋白純度不高，尤其是高溫米糠粕蛋白過度變性，結構更為復雜，極大限制其在食品工業中的應用，至今沒有實現工業化生產[4]。這與米糠蛋白復雜的組成成分密切相關，米糠中含有37%清蛋白、36%球蛋白、22%谷蛋白與5%醇溶蛋白，而且這些蛋白具有較強的聚合和大量二硫鍵，溶解性很差[5]。另一方面，為了防止米糠油脂酸敗而進行的熱穩定化處理可導致蛋白嚴重變性，蛋白交聯作用增加，結構更為復雜，溶解性等功能性質下降[6]。由于米糠中膳食纖維和植酸含量較高，加劇米糠組分間的相互聚結，使蛋白很難分離。

前期研究表明，蒸汽閃爆（SFE）處理可有效提高高溫米糠粕中蛋白質的提取率和氮溶解指數[7]。這主要是由于蒸汽閃爆處理使物料同時受到高溫蒸煮和蒸汽瞬間釋放所產生的機械剪切作用，一方面可使米糠細胞壁結構破壞，半纖維素降解，包裹鑲嵌其中的蛋白質被釋放[8]；另一方面，這些作用勢必會引起高溫米糠粕中蛋白質分子結構、理化性質的變化，進而影響其溶解性等功能性質[9-10]。另外，根據美拉德反應的原理和特征可知，蒸汽閃爆過程中存在的高溫蒸煮作用可能會引起高溫米糠粕中的蛋白質與糖類物質共價結合，蛋白質分子極性增加，空間結構變化，溶解性等功能性質變化[11-12]。1988年Kato等[13]首次應用干熱法對蛋白質進行糖基化改性，發現接枝物的溶解性、乳化性等功能特性均有很大改善，大量研究報道均證實蛋白質糖基化改性能在一定程度上改善其功能性質，但關于蒸汽閃爆對米糠粕美拉德反應的研究尚屬空白。試驗采用蒸汽閃爆技術對高溫米糠粕進行處理，探討蒸汽閃爆對米糠蛋白美拉德反應的影響，為進一步研究蒸汽閃爆對高溫米糠粕中蛋白質結構和功能特性的影響提供理論基礎，并為開發高溫米糠粕中蛋白質提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高溫米糠粕（黑龍江省北大荒米業集團有限公司），米糠在130 ℃、30 min濕熱穩定化處理后，脫脂制成的粉末，其蛋白質含量為18.23%，含水率10.3%。

2, 4, 6-三硝基苯磺酸（TNBS，美國Sigma-Aldrich公司）；L-賴氨酸（分析對照品，上海吉至生化科技有限公司）；濃鹽酸、濃硫酸、氫氧化鈉、溴化鉀、硫酸鉀、硫酸銅、硼酸、十二烷基硫酸鈉（SDS）、3, 5-二硝基水楊酸、葡萄糖（均為分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

QBS-80蒸汽閃爆機（鶴壁市正道生物能源有限公司）；EA3000全自動元素分析儀（意大利EuroVector儀器公司）；NR60CP手提式多功能色差儀（深圳市三恩時科技有限公司）；S433D全自動氨基酸分析儀（德國Sykam公司）；RF-5301PC熒光分光光度計（日本島津公司）；TENSOR27傅里葉變換紅外光譜儀（德國BRUKER光譜儀器公司）；A11分析研磨機（德國IKA公司）；UDK152全制動凱氏定氮儀（意大利VELP公司）；X18A鋁模塊自動消化裝置（上海晟聲自動化分析儀器有限公司）；PDU-1100冷凍干燥機（日本東京理化公司）；T6新世紀型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）。

1.3 方法

1.3.1 蒸汽閃爆處理

將高溫米糠粕粉碎，過60目篩，取400 g米糠粕粉放入蒸汽閃爆機的處理腔中，通入一定壓力的飽和蒸汽并保壓一定時間，在極短時間（ms）內進行蒸汽閃爆處理，收集閃爆樣品，-20 ℃保存備用。

1.3.2 米糠蛋白質的制備

稱取一定量的蒸汽閃爆處理前后的高溫米糠粕，按料液比1∶15加入蒸餾水混合，調節pH 9.0，在45℃水浴下攪拌浸提2 h后，以4 000 r/min離心15 min，收集上清液，20 ℃下調pH至4.6，靜置30 min，以4 000 r/min離心15 min，棄去上清液，蒸餾水洗滌沉淀2次，相同方法離心，用去離子水溶解沉淀，調節pH 7.0，冷凍干燥后得到米糠蛋白。

1.3.3 蛋白質得率、純度的測定

采用mico-Kjeldahl法測定米糠蛋白中蛋白質含量，同時測定米糠粕中蛋白質含量，按式（1）計算蛋白質得率，按式（2）計算米糠蛋白純度。

1.3.4 還原糖的測定

準確稱取一定量蒸汽閃爆處理前后的高溫米糠粕，采用3, 5-二硝基水楊酸（DNS）法[14]測定還原糖含量。

1.3.5 氮元素和碳元素的測定

采用意大利Euro Vector EA3000全自動元素分析儀測定米糠蛋白中氮元素和碳元素含量。

1.3.6 米糠蛋白色澤的測定

采用手提式多功能色差儀測定米糠蛋白的色差值L*，a*，b*。

1.3.7 自由氨基的測定

參考Lertittikul等[15]的方法測定。稱取一定量米糠蛋白樣品，溶于0.1 g/100 mL SDS溶液中，配制質量濃度0.2 g/100 mL的蛋白質溶液。取0.4 mL蛋白質溶液，加入2 mL pH 8.2的磷酸鹽緩沖溶液和1 mL 0.1 g/100 mL TNBS試劑，振蕩混勻，在50 ℃水浴中避光反應1 h后，加入2 mL 0.1 mol/L HCl終止反應，室溫下放置30 min后，以蒸餾水為空白，420 nm下測定吸光度。以L-賴氨酸制作標準曲線，計算樣品中自由氨基含量。

1.3.8 氨基酸組成分析

精確移取一定量米糠蛋白樣品于水解管中，加入一定量的6 mol/L HCl溶液，密閉，110 ℃下水解24 h，冷卻，定容，過濾，干燥，加入一定量的0.02 mol/L HCl溶液，真空下放置30 min后加入氨基酸自動分析儀測定除色氨酸以外的其他氨基酸含量。

1.3.9 傅里葉紅外光譜（FTIR）分析

參考齊軍茹等[16]的方法測定。準確稱取適量干燥后樣品，加入一定量溴化鉀，研磨成均勻的粉末，壓成薄片，采用TENSOR27型傅里葉變換紅外光譜儀作全波段（4 000～500 cm-1）掃描，掃描32 次。

1.3.10 熒光光譜分析

參考Li等[17]的方法測定。分別取各米糠蛋白溶解于磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0、0.01 mol/L），配置成1.0 mg/mL的溶液。熒光光譜的激發波長為340 nm，發射光譜掃描范圍為360～510 nm，激發和發射狹縫寬均為5 nm，掃描速度10 nm/s。

1.3.11 數據統計分析

每個試驗重復3次，結果表示為平均值±SD。數據統計分析采用SPSS 13.0軟件（p＜0.05表示差異顯著，p＞0.05表示差異不顯著）。傅里葉紅外光譜和熒光光譜采用Origin 8.0軟件作圖，其他采用Microsoft Excel 2010軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 高溫米糠粕中還原糖含量變化

有研究表明，蒸汽壓力0.9～2.1 MPa、保壓時間90～210 s時，蒸汽閃爆處理高溫米糠粕能有效提高米糠蛋白的氮溶解指數[7]。因而，選擇0.9，1.5和2.1 MPa這3個蒸汽壓力，在90，150和210 s的保壓時間下進行蒸汽閃爆，處理后的高溫米糠粕分別表示為：HTDDRB-0.9-150、HTDDRB-0.9-210、HTDDRB-1.5-90、HTDDRB-1.5-150、HTDDRB-2.1-90、HTDDRB-2.1-210，未處理的高溫米糠粕標記為RHTDDRB，制備的米糠蛋白分別標記為RBPI-0.9-150、RBPI-0.9-210、RBPI-1.5-90、RBPI-1.5-150、RBPI-2.1-90、RBPI-2.1-210，未處理的高溫米糠粕制備的米糠蛋白標記為RBPI。

圖1為不同蒸汽閃爆條件處理后高溫米糠粕中還原糖含量變化。未處理的高溫米糠粕（RHTDDRB）中的還原糖含量僅2.44%，蒸汽閃爆處理后還原糖含量顯著（p＜0.05）上升，且受蒸汽壓力和保壓時間影響較大，在2.1 MPa、210 s條件下，還原糖含量增至6.28%，與RHTDDRB相比提高1.57倍。有研究表明蒸汽閃爆可使米糠中的纖維組分在蒸汽蒸煮和機械剪切作用下部分降解為低分子的糖類[8]，從而導致高溫米糠粕中的還原糖含量上升。

圖1 蒸汽閃爆對高溫米糠粕中還原糖含量的影響

2.2 米糠蛋白得率、純度及氮碳元素含量變化

表1為高溫米糠粕經不同蒸汽閃爆處理后，所得米糠蛋白的得率、純度及氮元素和碳元素含量的變化情況。未經蒸汽閃爆的高溫米糠粕制備的米糠蛋白的得率僅27.42%，而經蒸汽閃爆處理后蛋白質得率顯著升高（p＜0.05），最高可升至48.61%（RBPI-2.1-210）；且蛋白質得率受蒸汽壓力影響顯著（p＜0.05），壓力從0.9 MPa上升到1.5 MPa時蛋白質得率從35.23%（RBPI-0.9-150）提高到45.86%（RBPI-1.5-150），提高30.17%，壓力從1.5 MPa上升到2.1 MPa時蛋白質得率從41.42%（RBPI-1.5-90）提高到46.50%（RBPI-2.1-90），提高了12.27%；同時發現在低壓下蛋白質得率隨保壓時間的變化較大，在0.9 MPa下保壓時間從150 s升到210 s，蛋白質得率提高10.28%，而在高壓下蛋白質得率隨保壓時間的變化較小，在2.1 MPa下保壓時間從90 s升到210 s，蛋白質得率僅提高4.54%。

從表1中可以發現，高溫米糠粕經蒸汽閃爆后制備的蛋白的純度顯著下降（p＜0.05），最高降幅為10.27%（從83.65%降到75.06%），并且隨著蒸汽壓力的升高蛋白質純度有所下降，保壓時間為210 s時蒸汽壓力從0.9 MPa上升到2.1 MPa，蛋白純度78.13%降至75.06%。結合蛋白質得率的變化，可以發現，蒸汽閃爆處理雖然使蛋白純度下降，但蛋白質的得率可以顯著增加（p＜0.05），同時在較高蒸汽壓力較短保壓時間（RBPI-2.1-90）和較低蒸汽壓力較長保壓時間（RBPI-1.5-150）下，蛋白質得率和純度變化均較小。

米糠蛋白純度的降低表明米糠蛋白中所含有的非蛋白質類物質增多[18]。因此，進一步對米糠蛋白所含的氮元素和碳元素進行測定，以探究蒸汽閃爆使蛋白純度降低的原因。從表1中的氮元素和碳元素含量變化中可以看出，高溫米糠粕經蒸汽閃爆處理后的米糠蛋白中氮元素含量顯著降低（p＜0.05），最高降幅26.65%（由15.27%降至11.20%），而碳元素的含量顯著增加（p＜0.05），最高升幅15.18%（由46.30%降至53.33%），且受蒸汽壓力和保壓時間的影響均較大。表明蒸汽閃爆處理后，米糠蛋白中氮元素含量較多的成分（如蛋白質）相對降低而碳元素含量較高的成分（如糖類）相對升高，這可能是由于蒸汽閃爆過程中，高溫米糠粕中的蛋白質與糖類物質發生美拉德反應，蛋白質分子中引入糖鏈，進而使得蛋白中碳元素增加而氮元素相對降低，且米糠蛋白純度降低。

表1 不同蒸汽閃爆處理條件下米糠蛋白的分析 %

2.3 米糠蛋白色澤變化

不同蒸汽閃爆處理前后的米糠蛋白的色差值L*，a*，b*見表2。高溫米糠粕經蒸汽閃爆處理后制備的米糠蛋白的L*值顯著降低（p＜0.05），最大降幅為35.58%，表明米糠蛋白的亮度降低，同時a*值顯著升高（p＜0.05），最高上升25.00%，表示紅色增加，且b*值顯著降低（p＜0.05），表示黃色降低，而藍色增加。米糠蛋白亮度（L*）的降低和紅色（a*）的增加表明蒸汽閃爆處理過程中發生了非酶褐變，即：美拉德反應或焦糖化反應，而焦糖化反應主要是由還原糖等低分子糖引起，淀粉等多糖不易發生焦糖化反應[19]，由此可以判斷米糠蛋白的色澤變化很可能是由高溫米糠粕中的糖類物質和蛋白質在蒸汽閃爆的作用下發生了美拉德反應，生成黑色的美拉德反應產物所引起的[20]。

表2 不同蒸汽閃爆處理條件下米糠蛋白的色澤

2.4 自由氨基分析

高溫米糠粕中除了含20%左右的蛋白質外，還含有膳食纖維、淀粉、低聚糖（棉籽糖、水蘇糖等）及還原糖等糖類物質，在高溫作用下極易發生美拉德反應，而美拉德反應主要是基于蛋白質分子中氨基酸側鏈的自由氨基和糖分子還原末端的羰基之間的羰氨反應[21]，歸屬于糖基化反應。因而可通過分析米糠蛋白中自由氨基含量的變化來判斷蒸汽閃爆過程中是否伴有美拉德反應的發生。

研究發現，蒸汽壓力和保壓時間對米糠蛋白得率、純度、氮碳元素組成及色澤的影響較大，因此后續試驗選擇一個低壓長時（0.9 MPa、210 s）、一個高壓短時（2.1 MPa、90 s）和一個高壓長時（2.1 MPa、210 s）的蒸汽閃爆處理條件下所得米糠蛋白為研究對象，與未經蒸汽閃爆的高溫米糠粕制備的米糠蛋白進行對比，研究蒸汽閃爆對高溫米糠粕中蛋白質的自由氨基、氨基酸組、傅里葉紅外光譜和熒光性質的影響。

圖2為不同蒸汽閃爆條件下所得米糠蛋白的自由氨基含量的變化情況。高溫米糠粕經蒸汽閃爆處理后，其米糠蛋白的自由氨基酸含量與未經處理的米糠蛋白（RBPI）相比顯著下降（p＜0.05）。RBPI-0.9-210與RBPI-2.1-90的自由氨基含量相差不顯著（p＞0.05），而RBPI-0.9-210與RBPI-2.1-210，RBPI-2.1-90與RBPI-2.1-210的自由氨基含量具有顯著差別（p＜0.05）。表明蒸汽壓力和保壓時間對米糠蛋白的自由氨基含量影響較大，自由氨基含量隨蒸汽壓力的增大和保壓時間的延長而下降，其中，RBPI-2.1-210的自由氨基含量最低為0.47 mmol/g，與RBPI的自由氨基含量（0.75 mmol/g）相比降低37.33%。另外，低壓長時和高壓短時的蒸汽閃爆條件對米糠蛋白自由氨基含量的影響不大。根據美拉德反應原理，米糠蛋白自由氨基含量的減少表明高溫米糠粕中的蛋白質與糖類物質發生共價結合，形成美拉德反應產物，進一步驗證米糠蛋白的純度、氮碳元素組成及色澤變化的結果。Zhang等[22]研究發現豆粕經蒸汽閃爆處理后，所得米糠蛋白中的自由氨基顯著降低，引發了糖基化反應；Xia等[23]在采用噴射蒸煮處理制備高溫米糠分離蛋白的研究中，發現處理后的米糠蛋白自由氨基明顯減少，與試驗結果一致。

2.5 氨基酸組成分析

由試驗可知，蒸汽閃爆處理過程可促使高溫米糠粕中的蛋白質與糖類物質發生美拉德反應，造成米糠蛋白中的自由氨基減少。蛋白質的自由氨基包括末端的α-氨基和側鏈的ε-氨基，為進一步研究糖類物質與米糠蛋白的結合部位，對不同蒸汽閃爆處理條件下制備的米糠蛋白進行氨基酸組成分析，結果見表3。

結果表明，蒸汽閃爆處理后米糠蛋白中的精氨酸和賴氨酸含量與未處理的對照樣相比顯著降低（p＜0.05），Xia等[23]在采用噴射蒸煮處理米糠粕的研究中發現，處理后的米糠蛋白的精氨酸和賴氨酸含量顯著降低，表明精氨酸和賴氨酸可能參與美拉德反應，Guan等[24]在研究微波合成大豆蛋白—糖接枝物時也得出同樣結論。由于精氨酸和賴氨酸的側鏈上存在自由氨基，可以與糖類物質發生美拉德反應，可以確定米糠蛋白中的精氨酸和賴氨酸在蒸汽閃爆的作用下與糖分子發生美拉德反應，使其含量降低。由表3還可發現，精氨酸和賴氨酸的含量隨著蒸汽壓力和保壓時間的升高而降低，在蒸汽壓力0.9 MPa時精氨酸和賴氨酸含量分別為10.56%和3.57%（RBPI-0.9-210），而在蒸汽壓力提高到2.1 MPa時其含量分別降為9.30%和2.96%（RBPI-2.1-210），同時在較高蒸汽壓力下（2.1 MPa）精氨酸和賴氨酸含量隨保壓時間的延長而降低，由9.66%和3.12%（RBPI-2.1-90）降到9.30%和2.96%（RBPI-2.1-210），表明蒸汽閃爆處理時高壓和長時有利于精氨酸和賴氨酸參與美拉德反應。

表3 不同蒸汽閃爆處理條件下米糠蛋白的氨基酸組成g/100 g蛋白質

2.6 傅里葉紅外光譜（FTIR）分析

傅里葉紅外光譜（FTIR）除了可用于蛋白質二級結構的分析外[25]，經常被用于美拉德反應產物的分析[26]。蛋白質與糖類物質發生共價結合即美拉德反應，可使蛋白質分子引入糖鏈，羥基增多，因而在3 700～3 200 cm-1（O—H和N—H的伸縮振動峰）和1 260～1 000 cm-1（—C—O—O糖苷鍵的伸縮振動）處的紅外吸收增強[26]。對米糠蛋白進行傅里葉紅外光譜掃描，結果如圖3所示。

圖3 不同蒸汽閃爆處理條件下米糠蛋白的傅里葉紅外光譜

高溫米糠粕經蒸汽閃爆處理后，其米糠蛋白在3 700～3 200 cm-1處的紅外吸收增強，其中，3 427 cm-1處的吸收強度增加最為顯著，同時1 260～1 000 cm-1處的吸收也明顯增加，并且增加的幅度受蒸汽壓力和保壓時間的影響較大，在2.1 MPa、210 s蒸汽閃爆條件下增加最為顯著。表明高溫米糠粕經蒸汽閃爆后，其蛋白分子上引入糖苷鍵，羥基增加，這進一步證明蒸汽閃爆過程中米糠蛋白質共價結合糖類物質，生成美拉德反應產物。

2.7 美拉德反應產物熒光光譜分析

美拉德反應產生的褐色物的前體物質具有典型的熒光特征，可作為美拉德反應的指示劑[27-28]，因此可通過米糠蛋白糖基化產物的熒光強度和光譜特征來研究美拉德反應的程度。美拉德反應產生的熒光物質的激發波長一般為340～370 nm，最大發射波長一般為420～440 nm。采用340 nm作為激發波長，對蒸汽閃爆處理前后制備的米糠蛋白進行掃描，結果如圖4所示。

高溫米糠粕經蒸汽閃爆處理后制備的米糠分白的熒光光譜的最大發射波長和熒光強度都發生較大變化。原高溫米糠粕制備的蛋白在440 nm處有最大熒光強度，而不同條件的蒸汽閃爆處理后，所得米糠蛋白分別在422，430和430 nm處有最大熒光強度，符合美拉德反應產物的熒光特征，且熒光強度均大幅度提高，進一步證實蒸汽閃爆處理過程中美拉德反應的發生。

從圖4中還看出，隨著蒸汽壓力增加或保壓時間延長，米糠蛋白的熒光強度明顯減弱，這主要與美拉德反應的進行程度有關。研究發現，熒光物質是類黑素的前體物，且熒光物質所需要的誘導時間較短[17]，因此當蒸汽壓力增大或保壓時間延長時，會有更多前期產生的熒光物質轉變為顏色物質，使熒光強度降低。因此蒸汽壓力和保壓時間可影響美拉德反應進程，這也可從米糠蛋白顏色變深得到驗證（見表2）。

圖4 不同蒸汽閃爆處理條件下米糠蛋白糖基化產物熒光光譜圖

3 結論

蒸汽閃爆處理可顯著提高高溫米糠粕中的還原糖含量和蛋白質得率，但同時蛋白純度出現不同程度降低，通過氮碳元素分析發現，其碳元素相對含量增加，米糠蛋白中引入碳元素含量較高的物質。蒸汽閃爆處理后所得米糠蛋白的色澤變深變暗，蛋白質的自由氨基及精氨酸和賴氨酸相對含量顯著下降，傅里葉紅外光譜顯示蛋白質分子上引入糖苷鍵，表明高溫米糠粕經蒸汽閃爆處理后，蛋白質中精氨酸和賴氨酸的自由氨基與糖分子的游離羰基發生美拉德反應，熒光光譜分析證實美拉德反應產物的存在，且反應進程受蒸汽壓力和保壓時間的影響顯著。