檢測不同菌群發酵產生有機酸種類與含量

龔云霞，齊小保

湖北省武漢市華中農業大學食品科技學院（武漢 430070）

作為中國飲食文化的象征，傳統的老面饅頭有著悠久的歷史，深受人們喜愛[1]，究其原因是獨特的發酵風味，同時特有的微生物菌系造成發酸面團特有的風味[2-3]。為了厘清中國的老面中微生物構成，系統研究來自湖北、河南、山東等地17份老面中的微生物菌群，發現主要的微生物菌群為釀酒酵母菌、植物乳桿菌、腸膜明串珠菌和戊糖乳桿菌。釀酒酵母菌在有氧條件下分解葡萄糖，生成CO2，在無氧條件下將葡萄糖分解為酒精和CO2[4]，大量CO2氣體截留于面團中網狀結構的面筋中，使面團蓬松、體積膨大，經蒸或烤之后形成疏松多孔的結構[5]。植物乳桿菌、腸膜明串珠菌和戊糖乳桿菌在發酵過程中，可以產生乳酸、乙酸和丙酸等有機酸，具有改善面團質構的作用，提高面團的營養價值，有助于形成饅頭特有風味[6]。

有機酸是影響饅頭風味的重要物質，已有的老面發酵研究顯示有機酸的檢測方法主要有總酸測定法[7]和氣質聯用法[8]，前者只能定性，后者難以同時分離多種有機酸，樣品處理過于繁瑣，適用范圍較窄，也有報道用離子色譜法進行有機酸[9]的分析，但影響因素多、靈敏度低。

運用HS-SPME-GC-MS檢測發酵風味物質已經有大量文獻方法報道[10-11]，但是該方法不適用于沸點較高的有機酸，難以定量分析，大大限制了發酵面團中有機酸的分析[12]。近幾年反相高效液相色譜（RPHPLC）被廣泛地應用于有機酸的分析，具有高效、快速的分離和定量多種有機酸的優點[13]，然而報道以檢測液體發酵酸奶或果酒中有機酸含量為主[14-15]，對于面團發酵的研究報道較少。為了厘清發酵面團中微生物菌群對于有機酸形成的種類和含量的作用，聯合使用HS-SPME-GC-MS和RP-HPLC方法檢測面團發酵物中有機酸的方法，通過對比不同微生物菌群發酵組，檢測發酵面團中有機酸的種類及其含量，揭示老面中菌株對有機酸形成的重要貢獻，篩選最佳發酵組，產生最佳的發酵酸味風味，有利于開發適應市場需求、安全和高效的復合發酵劑。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

SPME裝置及萃取纖維頭（美國Supelco公司）；6890N-5975 GC-MS儀、微量進樣器（10 μL，美國安捷倫公司）；高效液相色譜儀e2695（美國沃特世）；四元梯度輸液泵（Alliance 2695型）；進樣器（Alliance 2695型）；紫外可見檢測器（2489型）；色譜軟件（2011年版Empower 3型）；可降溫柱溫箱。

L-乳酸（98%（T））、丙酮酸（98%（T））、琥珀酸（GCS）、磷酸（GR）、冰乙酸（HPLC）、草酸二水合物（MSDS）、丙酸（GC）、正丁酸（GC）、甲醇（HPLC）（阿拉丁）；磷酸二氫鉀（AR）、氯化鈉（AR）（國藥集團）；超純水（Milli Q）；面粉（市售，香滿園小麥粉）；YPD、MRS培養基（Solarbio公司）。

1.2 樣品前處理

1.2.1 菌懸液的制備

釀酒酵母菌（HBCZ J4）、植物乳桿菌（WHQS 8）、腸膜明串珠菌（GSJQ 9）和戊糖片球菌（HBJZ4）均來源研究室分離保藏。通過YPD和MRS液體培養基將釀酒酵母、植物乳桿菌、腸膜明串珠菌和戊糖乳桿菌培養至對數生長中期，離心收集細胞，用生理鹽水洗滌2次，重懸于生理鹽水中，并通過分光光度法調整至OD600nm=0.40，備用。

1.2.2 無菌面粉液的制備

為了模擬老面發酵規則，使用無菌面粉溶液（SFS）代替面團。10 g/100 mL SFS制劑為：100.00 g面粉，補充蒸餾水至1 000 mL，攪拌均勻，調至pH 7.00，121 ℃滅菌20 min。

1.2.3 進樣前處理

氣相色譜樣品前處理：將表1中的各組分均勻混合后37 ℃發酵至體積漲大1倍，發酵樣品用生理鹽水2倍稀釋，存放于20 mL頂空小瓶中備用。

液相色譜樣品前處理：各菌群組合發酵SFS方法同上，發酵樣品用磷酸鹽溶液2倍稀釋，4 ℃靜置提取2 h，超聲處理10 min，離心（12 000 r/min，30 min），取上清液，經0.45 μm濾膜過濾，保存于液相色譜進樣瓶備用。

表1 不同發酵組菌株組合發酵配方

1.3 氣相色譜試驗方法

Supelco纖維支架與2 cm-50/30 μm DVB/Carboxen/PDMS（Sigma）纖維共同使用。纖維在270 ℃下老化1 h，平衡20 min后，纖維暴露于氣相色譜樣品組中，纖維頭插入液體表面上1.5 cm處40 min，將纖維解吸到氣相色譜（GC）進樣器，250 ℃下進行5 min，于Innowax（Agilent）毛細管柱（30 m，0.32 mm，0.25 μm）上進行分析[16]。GC分析條件：爐溫設定為40℃，保持3 min，以3 ℃/min加熱至160 ℃，以8 ℃/min加熱至220 ℃，并保持3 min；純度99.999%氦氣，流速1.0 mL/min，進樣器溫度250 ℃；噴油器以不分流模式運行；火焰離子化檢測器檢測器操作。質譜檢測器條件：70 eV電子能量，35 μA燈絲發射電流，230 ℃離子源溫度，150 ℃四極棒溫度，280 ℃界面溫度，30～550 AMU/s質量掃描范圍[17]。方法獨立重復3次。

通過GC-MS分析儀進行定性分析，并使用C6～C25正烷烴的保留時間計算每個色譜峰的保留。運用計算機光譜（NIST05/WILE7.0）進行初步搜索和數據分析，結合文獻保留指數進行比較和手動光譜儀分析以確認揮發性物質的組成，篩選發酵樣品中的有機酸種類及相對百分含量。

1.4 液相色譜試驗方法

1.4.1 液相色譜條件

液相色譜柱：Onlysci GS-120-5-C18-AQ（4.6 mm ID×250 mm）；參照相關文獻，流動相為5%CH3OH-0.02 mol/L KH2PO4（pH 2.5）溶液，進樣量20 μL，柱溫設置25±5 ℃；流速0.5 mL/min；檢測波長215 nm。

1.4.2 標準品的選擇與制備

根據已有的報道，釀酒酵母菌單獨發酵面粉產生的有機酸有乙酸、乳酸[18]、丙酸和丁酸[19]，與乳酸菌混合發酵能夠產生丙酮酸[20]和琥珀酸[21]，在前期研究中也發現有草酸產生。因此選定乳酸、草酸、琥珀酸、丙酮酸、乙酸、丙酸和丁酸7種有機酸用于檢測方法的建立。

標準溶液的配制：精確稱取0.8 g乳酸、草酸、琥珀酸，用磷酸鹽溶液定容至10 mL；丙酮酸、乙酸、丙酸和丁酸均為液體，移取適量樣品用磷酸鹽溶液定容至10 mL。由于丙酮酸、乙酸、丙酸、丁酸均為液體，均須使用NaOH溶液標定儲備液濃度，采用國標法計算濃度。通過矯正，確定混合標準液中草酸濃度0.34 mg/mL，丙酮酸濃度1.48 mg/mL，乳酸濃度13.14 mg/mL，乙酸濃度10.67 mg/mL，丙酸濃度15.29 mg/mL，丁酸濃度18.36 mg/mL，琥珀酸濃度12 mg/mL。將混合標準液分別用磷酸鹽溶液稀釋5，10，20，50，100，200，500和1 000倍，經0.45 μm濾膜過濾，存于液相色譜進樣瓶。

1.4.3 檢測方法

將不同菌株組合發酵樣品與混合有機酸標準品采用相同洗脫程序，通過保留時間、樣品加標和各有機酸紫外吸收光譜來定性，將各有機酸標準溶液及峰面積外標法定量，得到7種有機酸標準曲線方程。精密度的測定采用標準液重復測定法，回收率的測定采用加樣回收率測定法[13]，檢測獨立重復3次。

1.5 統計學分析

使用完全隨機化的設計來計劃研究，并且使用SPSS 22.0對試驗數據進行方差分析。

2 結果與討論

2.1 HS-SPME-GC-MS檢測有機酸

圖1為發酵組5的HS-SPME-GC-MS檢測結果圖，表2展示不同發酵組中有機酸種類。HS-SPME-GCMS結果顯示發酵液能檢測到4種有機酸，分別是丙酸、丙烯酸、草酸和2-乙基己酸，前3種所有的發酵組均可檢測到，只有2-乙基己酸在4種菌種發酵組5中檢測到，說明混合發酵會產生更多的發酵酸味。在同類型的研究中檢測到的有機酸種類有乳酸、乙酸[22]、丁酸、己酸、辛酸[23]、戊酸[24]和一些短鏈酸[25]，通過研究發現釀酒酵母與乳酸菌發酵面粉代謝產生有機酸主要可分為兩類：非揮發性有機酸和揮發性有機酸，但是其相對含量很低。此檢測方法并未檢測到乳酸菌發酵的特征有機酸——乳酸[26]，一方面是因為試驗儀器檢出限高；另一方面是由于沒有根據樣品中有機酸的不同類型構建樣品前處理和檢測方法[27]，因此如果采用HS-SPME-GC-MS方法精確地檢測發酵液中有機酸種類及含量需要復雜的樣品處理方法，以及根據有機酸的類型調試不同的氣相檢測程序，這樣的檢測方法既不快速也不便捷。

圖1 發酵組5樣品GC-MS檢測結果

表2 HS-SPME-GC-MS檢測不同發酵組液中有機酸

2.2 RP-HPLC方法檢測有機酸

2.2.1 標準酸工作曲線

圖2顯示草酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、丙酸和丁酸的保留時間分別是5.806，7.785，9.773，10.42，14.08，19.713和37.75 min，7種目標有機酸單個標準液或混合標準液都得到很好的分離，表3表明7種標準品有機酸的濃度與峰面積有極好的線性關系，相關系數R2均大于0.999 0。

2.2.2 精密度試驗與加樣回收率試驗

精密度試驗中測定7種有機酸組分色譜圖的保留時間和峰面積，計算相對標準偏差（RSD），7種有機酸的保留時間的RSD值在0.02%～0.64%之間，7種有機酸的峰面積的RSD值在0.048%～0.15%之間，表明儀器精密度良好；從7種有機酸組分的回收率和RSD可以看出，7種有機酸組分回收率在94.85%～99.51%之間，7種有機酸組分的RSD在0.23%～1.94%之間，說明方法準確可靠。

2.2.3 不同發酵組中有機酸含量的測定

從整體分析，對不同發酵組進行HPLC檢測，結果如表4所示，不同菌株發酵SFS中均含有7種目標有機酸。乳酸和乙酸含量占據整體有機酸含量的絕對多數，存在極顯著性差異（p＜0.01），為發酵液有機酸的主要組分，其中在各組發酵樣品中乳酸含量始終最高，并且產生有機酸含量由大到小依次是：乳酸、乙酸、丁酸、草酸和丙酮酸。在各組發酵組中，草酸與丙酮酸含量較為接近，由于發酵菌株的區別，乳酸含量的變化最為明顯，乙酸含量也有比較明顯的變化。

從各個發酵組分析，釀酒酵母利用Ehrlich途徑通過氨基轉移、脫羧和氧化還原反應將氨基酸轉化為相應的醇和酸[28]，從表4結果可以判斷，只有釀酒酵母菌發酵時，產生的乳酸與乙酸含量相差不大，表明釀酒酵母菌發酵時產乳酸與乙酸的能力相當；對比發酵組2、3和4的有機酸結果發現植物乳桿菌與戊糖片球菌的參與極顯著地提升乳酸含量（p＜0.01），可能的原因是戊糖片球菌為同型發酵乳酸菌，腸膜明串珠菌屬于異型發酵乳酸菌，而植物乳桿菌則為兼性發酵乳酸菌[29]。同型發酵僅通過EMP途徑產生乳酸；而異型發酵除了產生乳酸外，還通過PK途徑和HK途徑產生乙醇和二氧化碳。試驗結果可以說明乳酸含量是與EMP途徑密切相關的，對比混合發酵組2、3、4和5，4種菌混合發酵組5產生的乳酸和乙酸含量最大，尤其乙酸含量相比其他3組有明顯增加，同時丙酸與丁酸含量處于適中，表明釀酒酵母菌與不同發酵類型的3種乳酸菌發酵面粉可以達到更好發酵效果。

圖2 7種有機酸混合標準HPLC圖譜

表3 7種標準有機酸的回歸方程

表4 各發酵組中7種有機酸濃度

3 結論

RP-HPLC檢測不同菌株發酵面粉中有機酸的方法：采用Onlysci GS-120-5-C18-AQ（4.6 mm ID×250 mm）色譜柱，流動相為5% CH3OH-0.02 mol/L KH2PO4（pH 2.5）溶液，流速0.5 mL/min，波長215 nm，對比分析HS-SPME-GC-MS與RP-HPLC檢測發酵面粉中常見有機酸。采用HS-SPME-GC-MS僅檢測到丙酸、丙烯酸、草酸和2-乙基己酸，有研究顯示乳酸和乙酸等低沸點的有機酸難以檢測到或極微弱地檢測到[30]。然而，RP-HPLC方法可同時準確分離和定量測定發酵面粉中常見的草酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、丙酸和丁酸7種有機酸，方法具有較高的準確度和較快的速度。通過對不同菌株組合發酵面粉產生有機酸檢測結果比較分析，釀酒酵母菌、植物乳桿菌、腸膜明串珠菌和戊糖片球菌混合發酵，特征性風味乳酸和乙酸含量顯著增加，可用于制作復合發酵劑并予以推廣。