QuECHERS-UHPLC-MS/MS法測(cè)定牛肉干中羅丹明B

毛敏霞，黃永橋，馬凱，簡(jiǎn)銀池，李占彬

貴州省分析測(cè)試研究院（貴陽(yáng) 550000）

羅丹明B（Rhodamine B），又名玫瑰紅B、堿性玫瑰精、蕊香紅B，俗稱花粉紅，是一種人工合成三苯甲烷類(lèi)堿性熒光染料，以氧雜蒽為母體，具有特殊的熒光特性，被廣泛應(yīng)用于造紙、紡織、皮革和環(huán)保等領(lǐng)域，是熒光分析常用的試劑[1-3]。因其具有高毒、高殘留和致癌、致畸、致突變等特點(diǎn)[4-6]，被國(guó)家列入《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單（第一批）》明令禁止在食品中添加[7]。根據(jù)整頓辦函[2011]1號(hào)、食品整治辦[2008]3號(hào)等文件精神，羅丹明B作為食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑，被納入食品安全監(jiān)督抽檢檢測(cè)項(xiàng)目。但羅丹明B具有著色持久、成本低廉且穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)，常被一些不法商販將其替代食品著色劑使用，給消費(fèi)者飲食安全帶來(lái)極大隱患[8-9]。因此建立可靠的分析方法是必要的，以加強(qiáng)市場(chǎng)監(jiān)管，打擊非法濫用。

目前已有報(bào)道關(guān)于羅丹明B檢測(cè)方法有分光光度法[9-10]、高效液相色譜（HPLC）法[12-14]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法[15-16]、表面增強(qiáng)拉曼（SERS）法[17-18]。羅丹明B常用的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)為SN/T 2430—2010《進(jìn)出口食品中羅丹明B的檢測(cè)方法》，樣品提取后經(jīng)凝膠色譜凈化系統(tǒng)（GPC）凈化，最后經(jīng)儀器測(cè)定[19]。但檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中用到的凝膠色譜凈化系統(tǒng)在一些基層實(shí)驗(yàn)室難以普及，且這些檢測(cè)方法前處理過(guò)程較為繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)，很難滿足快速篩查要求。QuEChERS技術(shù)最初用來(lái)分析水果和蔬菜中的多種農(nóng)藥殘留，也用來(lái)分析如水產(chǎn)品和畜禽肉等非蔬菜類(lèi)物質(zhì)中痕量污染物，市售QuEChERS產(chǎn)品種類(lèi)較多。試驗(yàn)采用QuEChERS法對(duì)樣品進(jìn)行處理，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，建立測(cè)定牛肉干中羅丹明B的分析方法。該方法具有前處理簡(jiǎn)單、樣品分析時(shí)間短、回收率高、準(zhǔn)確度和精密度好等優(yōu)點(diǎn)，適用于大批量樣品的快速分析檢測(cè)，為牛肉干食品的質(zhì)量控制提供檢測(cè)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 主要儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀（Agilent 1290）、三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜（Agilent 6470 QQQ，配有ESI源）（美國(guó)Agilent公司）；刀式研磨粉碎儀（GM200，德國(guó)Retsch公司）；電子天平（LT2002，常熟市天量?jī)x器有限公司）；多管渦旋混合器（UMV-2，北京普立泰科儀器有限公司）；離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；渦旋混合器（XW-80A，上海米青科實(shí)業(yè)有限公司）；超純水機(jī)（Milli-Q，美國(guó)Millipore公司）；Bond ElutQuEChERS分散SPE凈化管（每支15 mL，50 mg PSA、150 mg C18、900 mg Na2SO4，美國(guó)Agilent公司）；0.22 μm PTFE濾膜（上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

1.1.2 主要試劑與材料

甲醇、乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司）；乙腈（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；甲酸（色譜純，上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；乙酸銨（優(yōu)級(jí)純，西亞試劑）；羅丹明B（純度＞99%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取10 mg（精確至0.1 mg）羅丹明B于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容刻度，混勻，配制成濃度1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃保存6個(gè)月。移取100.0 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。移取100.0 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。從100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液移取200.0 μL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成2 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，備用。

1.3 色譜條件

ZORBAX Eclipse Plus-C18反相色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國(guó)Agilent公司）；流動(dòng)相A，0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)相B，乙腈；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣體積5.0 μL；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源，電噴霧離子源（ESI），正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；毛細(xì)管電壓4.5 kV；霧化器壓力45 psi；干燥氣流速10 L/min；干燥氣溫度300 ℃；鞘氣流速10 L/min；鞘氣溫度300 ℃；其他質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

表2 質(zhì)譜條件

1.5 樣品前處理

稱取2.00 g粉碎后的試樣于50 mL聚四氟乙烯離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL乙腈溶液，以2 500 r/min渦旋振蕩10 min，以4 500 r/min常溫離心5 min。移取3 mL上清液于QuEChERS分散SPE凈化管中，渦旋2 min，以4 500 r/min常溫離心5 min。取上清液，過(guò)0.22 μm PTFE針式濾膜，待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理的優(yōu)化

2.1.1 提取

對(duì)甲醇、乙腈、0.1%甲酸甲醇、0.1%甲酸乙腈、甲醇乙腈溶液（1∶1，V/V）、0.1%甲酸甲醇乙腈溶液（1∶1，V/V）、乙腈-水溶液（8∶2，V/V）、0.1%甲酸乙腈-水溶液（8∶2，V/V）不同提取溶劑進(jìn)行考察。結(jié)果表明，使用甲醇和乙腈作為提取溶劑時(shí)，提取效果相當(dāng)，提取率均大于90%，且優(yōu)于其他幾種提取溶劑；做實(shí)際樣品測(cè)定時(shí)，使用甲醇作為提取溶劑，樣品有假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)，故選取乙腈作為提取溶劑。

考察渦旋振蕩器與超聲儀對(duì)提取效果的影響，結(jié)果表明，在相同提取時(shí)間內(nèi)，使用渦旋震蕩器進(jìn)行提取時(shí)目標(biāo)物提取率更高，故試驗(yàn)選取渦旋振蕩器進(jìn)行振蕩提取。在此基礎(chǔ)上，試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化渦旋振蕩提取時(shí)間（5，10，15和20 min），結(jié)果表明，渦旋振蕩提取10 min以上，隨著渦旋振蕩時(shí)間增加，目標(biāo)物的提取效果趨于穩(wěn)定，故選取渦旋振蕩10 min進(jìn)行樣品提取。

2.1.2 凈化

分別對(duì)QuEChERS分散SPE凈化管、PSA/C18凈化管及MCX固相萃取小柱凈化效果進(jìn)行了考察，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，3種凈化方法效果都較為理想，但使用MCX固相萃取小柱因處理過(guò)程繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)，不適用大批量樣品的快速處理；使用QuEChERS分散SPE凈化管凈化效略顯優(yōu)于PSA/C18凈化管的凈化效果，回收率均在90%以上，對(duì)目標(biāo)物吸附很小，且處理簡(jiǎn)單快捷，適用于大批量樣品的處理。故選取QuEChERS分散SPE凈化管用作樣品的凈化。

圖1 不同凈化方法的凈化效果

2.2 色譜條件的選擇

試驗(yàn)采用超高效液相色譜，選取50 mm×1.8 μm的超高壓色譜柱，與傳統(tǒng)的色譜柱相比，可承受更高的壓力，峰形更好，分析時(shí)間更短。此外，選擇流速0.3 mL/min，對(duì)質(zhì)譜部分有較好霧化效果，減少溶劑對(duì)質(zhì)譜分析的影響。

流動(dòng)相的選擇一方面要考慮目標(biāo)化合物的色譜分離情況，另一方面要考慮質(zhì)譜分析條件。由于此次試驗(yàn)的提取溶劑和上機(jī)測(cè)定溶劑為乙腈，且目標(biāo)物均易溶于乙腈，因此選用乙腈作為流動(dòng)相B；試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，選擇乙腈-0.1%甲酸水為流動(dòng)相體系，在該條件下，目標(biāo)物有較好的質(zhì)譜響應(yīng)，進(jìn)一步對(duì)梯度洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化，使目標(biāo)物有較好分離，縮短樣品分析時(shí)間，提高分析效率；試驗(yàn)對(duì)25，30，40和50 ℃不同柱溫進(jìn)行考察，結(jié)果表明，采用40 ℃柱溫時(shí)，目標(biāo)物分離效果較好，從而確立了最佳色譜條件，樣品單次分析時(shí)間僅需3 min，滿足大批樣品的快速檢測(cè)分析。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與定量限

將1.2小節(jié)中配制出的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液稀釋至1/100，1/50，1/20，1/10，1/5，1/2和1倍，得到0.02，0.04，0.10，0.20，0.40，1.00和2.00 μg/L系列梯度混合溶液。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積（Y）對(duì)其質(zhì)量濃度（X，μg/L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，羅丹明B在0.02～2.00 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999 4，適用于定量分析。按照信噪比≥3（S/N≥3）對(duì)最低檢測(cè)限（LOD）進(jìn)行測(cè)定，定量限（LOQ）以最低檢測(cè)限的3倍進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 羅丹明B的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)（R2）、檢出限（LOD）和定量限（LOQ）

2.4 準(zhǔn)確度和精密度

選取陰性牛肉干樣品進(jìn)行添加試驗(yàn)，驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確度和精密度。分別添加0.2，0.4和1.0 μg/kg這3個(gè)不同濃度的添加水平，每個(gè)添加水平做6個(gè)平行，按照1.5小節(jié)的樣品前處理方法進(jìn)行提取凈化，3個(gè)加標(biāo)濃度連續(xù)做3 d，以考察方法的準(zhǔn)確度和精密度，準(zhǔn)確度以相對(duì)偏差表示，精密度以變異系數(shù)（C.V.）表示，計(jì)算加標(biāo)回收率、日內(nèi)變異系數(shù)和日間變異系數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白樣品和加標(biāo)樣品的色譜圖見(jiàn)圖2～圖4，方法的準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，目標(biāo)分析物的準(zhǔn)確度均小于10%，日內(nèi)回收率在91.8%～101.4%之間，日內(nèi)變異系數(shù)（C.V.）在1.6%～3.7%之間；日間回收率在90.7%～99.6%之間，日間變異系數(shù)（C.V.）在1.8%～3.1%之間。方法回收率高，準(zhǔn)確度和精密度良好，能夠滿足牛肉干樣品中羅丹明B殘留量的測(cè)定。

2.5 方法的應(yīng)用

應(yīng)用建立的方法對(duì)購(gòu)自市場(chǎng)上的60份牛肉干樣品進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定2次，其中有1份樣品羅丹明B檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，檢測(cè)結(jié)果為3.98 μg/kg，其余樣品均未檢出。

表4 羅丹明B的準(zhǔn)確度和精密度

圖2 羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 μg/L）MRM色譜圖

圖3 牛肉干空白樣品加標(biāo)（1 μg/kg）MRM色譜圖

圖4 牛肉干空白樣品MRM色譜圖

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀建立牛肉干中羅丹明B殘留量的快速檢測(cè)方法，對(duì)樣品前處理方法、色譜、質(zhì)譜等條件進(jìn)行優(yōu)化，確立以乙腈作為提取劑，用QuEChERS分散SPE凈化管凈化。結(jié)果表明，樣品在3 min內(nèi)完成分析，羅丹明B在0.02～2.00 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)為0.999 4，檢出限為0.1 μg/kg，在0.2，0.4和1 μg/kg這3個(gè)添加濃度水平，目標(biāo)分析物的準(zhǔn)確度均小于10%，日內(nèi)回收率在91.8%～101.4%之間，日內(nèi)變異系數(shù)在1.6%～3.7%之間；日間回收率在90.7%～99.6%之間，日間變異系數(shù)在1.8%～3.1%之間。方法具有操作簡(jiǎn)單、樣品分析時(shí)間短、回收率高、準(zhǔn)確度和精密度好等優(yōu)點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確定性和定量牛肉干中羅丹明B的痕量分析，適用于牛肉干中羅丹明B的快速篩查與確證，為牛肉干中羅丹明B殘留量的檢測(cè)提供技術(shù)支撐，為監(jiān)管部門(mén)及食品安全提供更多的理論依據(jù)。

利用建立的方法對(duì)購(gòu)自市場(chǎng)上的牛肉干樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果有1份樣品檢測(cè)出羅丹明B，檢測(cè)結(jié)果為3.98 μg/kg，說(shuō)明羅丹明B即使被列為禁止在食品中使用的工業(yè)染料，但還是有不法商販在利益驅(qū)使下違法將羅丹明B代替食品著色劑使用，以次充好，對(duì)消費(fèi)者健康產(chǎn)生較大安全風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)引起監(jiān)管部門(mén)重視。