免疫球蛋白樣轉錄物5在膠質母細胞瘤中的表達及對患者預后的評估價值

劉鑫，李民，高興春#

1西安醫學院，西安 710000

2陜西省人民醫院神經外科，西安 710068

膠質母細胞瘤是神經外科最常見原發性顱腦腫瘤，好發于幕上大腦半球各處，呈浸潤性生長，在所有膠質瘤中惡性程度最高，常可同時侵犯多個腦葉及深部結構，臨床療效較差，預后不良，70%～80%患者的病程僅3～6個月，病程超過1年的患者不超過10%[1-2]。目前，僅發現遺傳因素、環境因素及腦部炎癥等因素可促進膠質母細胞瘤發生發展，且這些因素對幫助臨床診療意義不大，而基于分子水平的相關研究較少[3]。數據顯示，近年來，膠質母細胞瘤發病率明顯升高，探討其發病機制，提高其早期診斷率及治療有效率尤為重要[4]。免疫球蛋白樣轉錄物5（immunoglobulin-like transcript 5，ILT5）基因是ILT家族的重要成員之一，主要表達于單核細胞、淋巴細胞及樹突狀細胞等免疫細胞表面，與機體免疫密切相關[5]。研究發現，ILT4在非小細胞肺癌和卵巢癌中均呈低表達，通過與其配體結合介導細胞內免疫絡氨酸抑制基序的負性調節，從而抑制機體淋巴細胞增殖與活化[6-7]。目前，關于ILT5與膠質母細胞瘤的研究較少，具有一定研究價值。本研究探討ILT5在膠質母細胞瘤中的表達情況，分析其與患者臨床特征的關系及對預后評估的價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年1月至2015年11月在陜西省人民醫院神經外科接受手術治療的膠質母細胞瘤患者。納入標準：①臨床癥狀、實驗室檢測、影像學檢查及術后病理診斷結果確診為膠質母細胞瘤；②術前未接受任何其他治療，生存期＞3個月；③卡氏功能狀態（Karnofsky performance status，KPS）評分≥50分；④臨床資料及隨訪資料均完整。排除標準：①繼發性膠質母細胞瘤；②膠質母細胞瘤復發；③合并其他惡性腫瘤；④失訪或因其他原因死亡。依據納入和排除標準，本研究共納入92例膠質母細胞瘤患者，其中男50例，女42例；年齡：＞40歲60例，≤40歲32例；KPS評分為（72.47±4.35）分。同期選取行正常腦組織切除減壓術的患者，排除合并腦部及其他部位良惡性腫瘤的患者，本研究共納入40例行正常腦組織切除減壓術的患者，其中男24例，女16例；年齡：＞40歲26例，≤40歲14例；KPS評分為（73.39±4.86）分。兩組患者性別、年齡及KPS評分比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 標本制備 取膠質母細胞瘤患者的膠質瘤組織和行正常腦組織切除減壓術的患者的正常腦組織，生理鹽水洗凈血跡及脂肪組織等，分為兩部分：一部分保存于RNA保存液中，-80℃冰箱保存；另一部分用石蠟包埋，室溫常規保存待檢。

1.2.2 實時熒光聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測ILT5mRNA 的相對表達量將組織從-80℃冰箱取出解凍后棄保存液，緩沖液洗凈：研磨組織3 min，按比例加入Trizol液，充分均漿，離心棄沉淀，加氯仿震蕩混勻，室溫靜置10 min，離心留上清，按比例加異戊醇，離心留上清，再加入75%乙醇，真空干燥8 min，提取總RNA。依據試劑盒說明書制備cDNA，反應體系：4 μl緩沖液、4 μl混合酶、2 μl引物、4 μl總RNA液和6 μl DEPC水；反應條件：30 ℃ 8 min，42 ℃ 30 min，72 ℃ 10 min；cDNA制備完成，于-20℃冰箱保存。實時熒光PCR擴增，反應液20 μl，包括1 μl上下游引物、1 μl cDNA、0.5 μl Taq DNA 聚合酶、0.5 μl dNTP、5 μl PCR混合液和7.5 μl DEPC水；擴增條件：95℃先2 min后15 s、60 ℃ 1 min，共40個循環，以GAPDH為內參，2-△△Ct計算ILT5mRNA的相對表達量，其中△Ct=CtILT5-CtGAPDH。ILT5上游引物為5'-GGCTGAGTCTGGGCCCCAGGACCCGCAT-3'，下游引物為5'-ATGCTAGGTAACGTAGCTTACGGTTACC-3'；GAPDH上游引物為5'-CCCTGTTGCTGTAGCCAAATTC-3'，下游引物為5'-ACCCACTCCTCCACCTTTGA-3'。

1.2.3 免疫組化法檢測ILT5蛋白的相對表達量石蠟標本切片，0.5 mm左右，60℃烤片待檢。二甲苯聯合不同濃度乙醇進行脫蠟，微波爐高溫修復，將組織置于3%的H2O2中3 min，緩沖液清洗3遍，從而阻斷內源性過氧化物酶。加入一抗（稀釋濃度為1∶300），4℃冰箱過夜，緩沖液清洗3遍；加入二抗（基本沒過組織即可），室溫避光孵育30 min，緩沖液清洗3遍。二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）染色10 s左右（具體根據實驗期情況而定）、蘇木素復染、梯度乙醇脫水、透明、封片。選擇視野清晰，染色良好的5個視野進行計數，每個視野分別計數1000個。

結果判定[8]：ILT5蛋白主要在細胞質中表達，本研究用染色指數法進行判定，陽性細胞所占比例評分：未見計0分，陽性細胞所占比例＜10%計1分，陽性細胞所占比例為10%～49%計2分，陽性細胞所占比例為50%～75%計3分，陽性細胞所占比例＞75%計4分；染色強度評分：無顯色計0分，淡黃色染色計1分，黃色染色計2分，棕黃色染色3分；將陽性細胞所占比例評分與染色強度評分相乘：＞4分為高表達，≤4分為低表達。

1.3 隨訪方法

所有膠質瘤組患者均須隨訪，隨訪方式主要包括門診復診、電話及微信平臺等，隨訪截止2018年11月，共3年，中位隨訪時間為26個月。詳細記錄患者復發及生存狀況，計算總生存期（overall survival，OS）。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對所有數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率的比較采用Logrank檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ILT5mRNA相對表達量和ILT5蛋白表達情況的比較

膠質瘤組織中ILT5mRNA的相對表達量明顯低于正常腦組織，差異有統計學意義（P＜0.01）。膠質瘤組織ILT5蛋白表達率低于正常腦組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 膠質瘤組織和正常腦組織中ILT5 mRNA相對表達量和ILT5蛋白表達情況的比較

2.2 不同臨床特征膠質母細胞瘤患者ILT5mRNA相對表達量的比較

不同性別膠質母細胞瘤患者ILT5mRNA相對表達量的比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；不同年齡、組織學分級、腫瘤直徑和腫瘤部位膠質母細胞瘤患者ILT5mRNA相對表達量的比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征膠質母細胞瘤患者ILT5 mRNA相對表達量的比較（n=92）

2.3 不同臨床特征膠質母細胞瘤患者ILT5蛋白表達情況的比較

不同性別、腫瘤部位膠質母細胞瘤患者ILT5蛋白表達情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；不同年齡、組織學分級及腫瘤直徑膠質母細胞瘤患者ILT5蛋白表達情況比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表3）

表3 不同臨床特征膠質母細胞瘤患者ILT5蛋白表達情況的比較（n=92）

2.4 ILT5蛋白與膠質母細胞瘤患者預后的關系

ILT5蛋白低表達患者中位生存時間為20.1個月（95%CI：17.4～22.8個月），短于ILT5蛋白高表達患者的28.1個月（95%CI：25.3～31.0個月），差異有統計學意義（P＜0.05）。ILT5蛋白高表達患者3年生存率44.1%（15/34），高于ILT5蛋白低表達患者的22.4%（13/58），差異有統計學意義（χ2=8.767，P=0.003）。（圖 1）

圖1 ILT5蛋白高表達（n=34）與ILT5蛋白低表達（n=58）膠質母細胞瘤患者的生存曲線

3 討論

ILT是近年發現的HLA-1受體家族，通過與相關配體結合可抑制細胞免疫反應[9-10]。目前，研究較多的抑制性ILT主要包括ILT2、ILT3和ILT4，均含有免疫絡氨酸抑制基序和IgSF區，與免疫相關性疾病密切相關；近年發現其還可在腫瘤細胞中表達，但具體作用機制尚不清楚[11-13]。ILT3和ILT4均在肺癌中異常表達，高愛琴[14]通過對57例非小細胞肺癌患者和A549/H1975/H460/A427四類非小細胞肺癌細胞株研究發現，ILT3在非小細胞肺癌組織及細胞中均呈陽性表達，可明顯降低TIL數量，但與患者性別、年齡、腫瘤類型、分化程度及臨床分期等臨床特征無關。張義[15]則通過50例胃癌組織、癌旁正常組織和6株胃癌細胞株中ILT2、ILT3及ILT4表達水平進行分析，結果發現，ILT2與胃癌相關性最強，有望成為胃癌診療的有效指標，與淋巴細胞HLA-G分子陽性表達密切相關，上述研究提示，ILT在腫瘤發生發展中可能發揮重要作用，但近年缺少ILT與腫瘤相關的研究報道。

本研究通過實時熒光PCR和免疫組化檢測發現，膠質瘤組織中ILT5mRNA的相對表達量和ILT5蛋白的表達率均低于正常腦組織，表明ILT5在膠質母細胞瘤中低表達，可能作為抑癌基因參與腫瘤的發生發展過程。隨后，本研究分析ILT5與膠質母細胞瘤臨床特征的關系發現，不同年齡、WHO分級及腫瘤直徑膠質母細胞瘤患者ILT5mRNA的相對表達量和ILT5蛋白表達率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），提示年齡越小、組織學分級高（Ⅲ～Ⅳ級）、腫瘤直徑越大的膠質母細胞瘤患者，ILT5mRNA的相對表達量越低。隨訪及Kaplan-Meier法繪制生存曲線圖發現，ILT5蛋白低表達患者中位生存期較短，3年總生存率較低，可認為年齡越小、組織學分級越高、腫瘤直徑越大的膠質母細胞瘤患者預后越差。本研究分析了ILT5在膠質母細胞瘤中的應用價值，但具體作用機制及診療價值尚不清楚，有待后續探討。

綜上所述，ILT5在膠質母細胞瘤中低表達，可能與年齡、WHO分級、腫瘤直徑及預后等密切相關，有望成為膠質母細胞瘤診療的新靶點。