口腔鱗狀細胞癌患者中膜型基質金屬蛋白酶1、基質金屬蛋白酶2的表達水平及臨床意義

楊易，蘇波，馬原軍，周順成

解放軍中部戰區總醫院漢口院區口腔科，武漢 430012

口腔鱗狀細胞癌是臨床中常見的口腔頜面部惡性腫瘤之一，雖然近年來該病的治療方法已有了較大的進步，但大部分患者因復發或轉移而死亡[1]。侵襲及轉移對于惡性腫瘤的發生發展具有重要意義，其中細胞外基質進入血管及淋巴是惡性腫瘤轉移的一個重要原因，細胞外基質是細胞間的動態網狀結構，包括膠原、蛋白聚糖及糖蛋白等，上述物質可在絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶或基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等作用下被降解，其中MMP在惡性腫瘤侵襲和轉移中的作用被廣泛關注，其在血管形成、傷口愈合、腫瘤浸潤等方面均具有重要作用[2-3]。目前發現的MMP類型已超過23種，其中膜型基質金屬蛋白酶1（membrane type 1-matrix metalloproteinase，MT1-MMP）及MMP2已被證實與多種惡性腫瘤的侵襲及轉移有關[4]。本研究探討了口腔鱗狀細胞癌組織中MT1-MMP、MMP2的表達水平及與患者臨床特征和生存情況的關系，旨在為口腔鱗狀細胞癌的臨床診治提供參考依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2013年1月至2016年1月于解放軍中部戰區總醫院漢口院區接受根治性手術治療的口腔癌患者。納入標準：①經病理檢查證實為原發性口腔鱗狀細胞癌；②接受根治性手術治療，且術前均未接受過放療、化療或免疫治療；③神志清醒，智力正常，與醫護人員交流無障礙。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②合并糖尿病、感染、貧血；③合并高血壓、心腦血管疾病。依據納入和排除標準，本研究共納入83例口腔鱗狀細胞癌患者。其中，男49例，女34例；年齡39～74歲，平均（58.39±6.93）歲；病變部位：牙齦15例，舌部31例，頰黏膜28例，腭部6例，其他3例。

1.2 免疫組織化學染色方法

步驟如下：①將手術獲得的口腔鱗狀細胞癌組織標本置于10%中性福爾馬林固定液中，室溫固定24 h，常規脫水后以石蠟包埋，將包埋后的組織切成4 μm厚的切片，置于烘箱中，67 ℃烘片2 h，脫蠟，以100%、95%、80%、70%的梯度乙醇進行水化后，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3次，每次5 min；②將沖洗后的切片置于0.01 mol/L檸檬酸緩沖液中，微波抗原修復15 min，冷卻至室溫后，PBS沖洗3次，每次5 min；③除去PBS，采用新配制的3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶活性，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次，每次5 min；④除去PBS，加入山羊血清，室內孵育20 min以封閉非特異性抗原抗體結合位點；⑤將多余的血清除去后，加入一抗 MMP2 或 MT1-MMP 50 μl，置于濕盒中4℃孵育過夜，次日在室溫下復溫1 h后以PBS沖洗3次，每次5 min；⑥除去PBS，加入生物素標記的二抗，室溫放置15 min，PBS沖洗3次，每次5 min；⑦加入新鮮配置的二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB），室溫孵育5 min，置于顯微鏡下觀察，顯色后以純凈水沖洗，終止染色；⑧蘇木素復染細胞核，以1%鹽酸乙醇分化，氨水促藍液返藍，超純水沖洗，80%、95%、100%梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察染色結果。以PBS代替一抗作為對照。

1.3 免疫組織化學染色結果判定

以免疫組化半定量分析方法對MT1-MMP、MMP2的表達情況進行判定，以細胞質中出現棕黃色顆粒為陽性。根據染色程度評分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。依據陽性細胞所占比例進行評分：無陽性細胞為0分，陽性細胞數＜10%為1分，10%～49%為2分，50%～80%為3分，＞80%為4分。染色程度評分與陽性細胞所占比例評分相加，≤1分為（-），2分為（+），3～4分為（++），≥5分為（+++）。其中（-）為陰性，（+）為弱陽性，（++）與（+++）為強陽性[5]。于200倍顯微鏡下選取5個以上視野進行觀察，注意避免壞死區，由2名具有5年以上工作經驗且中級以上職稱的病理科醫師對結果進行判定，結果不一致時請第3名專家進行判定。

1.4 隨訪

采用門診或電話方式對患者進行隨訪，隨訪截止時間為2019年1月30日。

1.5 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件對數據進行統計分析，計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；采用Spearman相關分析法進行相關性分析；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同臨床特征口腔鱗狀細胞癌患者口腔鱗狀細胞癌組織中MT1-MMP、MMP2表達情況的比較

TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、中-低分化、有淋巴結轉移、復發的口腔鱗狀細胞癌患者口腔鱗狀細胞癌組織中MT1-MMP的強陽性表達率分別高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無淋巴結轉移、未復發的口腔鱗狀細胞癌患者，差異均有統計學意義（χ2=23.971、9.169、6.556、8.204，P＜0.05）；TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、中-低分化、有淋巴結轉移、復發的口腔鱗狀細胞癌患者口腔鱗狀細胞癌組織中MMP2的強陽性表達率分別高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無淋巴結轉移、未復發的口腔鱗狀細胞癌患者，差異均有統計學意義（χ2=5.459、5.655、5.032、4.814，P＜0.05）。不同性別、年齡、腫瘤部位、浸潤情況口腔鱗狀細胞癌患者口腔鱗狀細胞癌組織中MT1-MMP和MMP2的強陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征口腔鱗狀細胞癌患者口腔鱗狀細胞癌組織中MT1-MMP、MMP2的表達情況（n=83）

2.2 MT1-MMP與MMP2表達的相關性

Spearman相關分析結果顯示，口腔鱗狀細胞癌患者中MT1-MMP與MMP2的表達呈正相關（r=0.471，P＜0.05）。（表2）

表2 口腔鱗狀細胞癌患者中MT1-MMP與MMP2的表達情況

2.3 生存分析

MT1-MMP強陽性表達患者的中位生存時間為24個月，明顯短于MT1-MMP弱陽性/陰性表達患者的32個月，差異有統計學意義（χ2=18.415，P＜0.01）。MMP2強陽性表達患者的中位生存時間為24個月，明顯短于MMP2弱陽性/陰性表達患者的33個月，差異有統計學意義（χ2=11.895，P＜0.01）。（圖1、圖2）

圖1 MT1-MMP強陽性（n=37）與弱陽性/陰性（n=46）口腔鱗狀細胞癌患者的生存曲線

圖2 MMP2強陽性（n=41）與弱陽性/陰性（n=42）口腔鱗狀細胞癌患者的生存曲線

3 討論

口腔鱗狀細胞癌是臨床中最常見的口腔癌，其發病率呈逐年上升之勢。惡性腫瘤細胞從原發病灶脫離并向遠處侵襲轉移是患者預后不良的一個重要原因，口腔癌患者死因多為轉移或復發。口腔癌的發生發展及轉移是一個由多方面因素影響的過程，其中細胞外基質是惡性腫瘤細胞侵襲轉移的第一道防線[6-8]。MMP是降解細胞外基質的主要酶，在惡性腫瘤的發生、發展、侵襲、轉移等方面均具有關鍵的調控作用[9]。

本研究結果顯示，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、中-低分化、有淋巴結轉移、復發的口腔鱗狀細胞癌患者口腔鱗狀細胞癌組織中MT1-MMP和MMP2的強陽性表達率分別高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無淋巴結轉移、未復發的口腔鱗狀細胞癌患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。不同性別、年齡、腫瘤部位、浸潤情況口腔鱗狀細胞癌患者口腔鱗狀細胞癌組織中MT1-MMP和MMP2的強陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。說明口腔鱗狀細胞癌患者中MT1-MMP和MMP2的表達情況與TNM分期、分化程度、淋巴結轉移情況及預后情況有關。雖然大部分MMP以可溶性酶原的形式存在，但近年來越來越多的膜型MMP被發現[10-13]：①MT1，2，3及5-MMP主要以Ⅰ型跨膜區與膜相連；②MT4、6-MMP以糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）與膜相連接；③MT23-MMP通過Ⅱ型跨膜區相連。其中MT1-MMP為首個鑒定出來的膜型MMP，目前已被證實在前列腺癌、乳腺癌、非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤組織中高表達。MT1-MMP不僅可直接或間接降解細胞外基質，從而為惡性腫瘤的遷移侵襲提供便利，還可脫落細胞表面分子并具有激活細胞外信號調節激酶的作用，從而增強細胞的遷移能力。因此，對口腔鱗狀細胞癌患者中MT1-MMP的表達水平及其與臨床特征的關系進行分析具有重要意義。MMP2是MT1-MMP激活產物，為鋅離子依賴性內肽酶，研究顯示，其可降解Ⅳ、Ⅴ型膠原及明膠等細胞外基質，從而發揮調節腫瘤血管生成及細胞生長的作用，被證實在多種惡性腫瘤組織中明顯高表達[14]。本研究的相關性分析結果顯示，MT1-MMP與MMP2的表達呈正相關（P＜0.05）。其原因可能是MT1-MMP可降解細胞外基質中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原及明膠、纖連蛋白、纖維蛋白等大分子，同時可介導激活MMP2，從而進一步降解更多的細胞外基質，導致腫瘤侵襲及轉移。MMP2酶原經MT1-MMP催化后與組織金屬蛋白酶抑制物2（tissue inhibitor of metalloproteinase 2，TIMP2）的 N 端相連，使TIMP2的C端與MMP2酶原的血紅素樣區域在空間上結合，該三聚體使MMP2酶原聚集于細胞表面，而與TIMP2結合的MTI-MMP易于激活MMP2酶原，兩者表達具有協同作用，因此表現為正相關[15]。本研究的生存分析結果顯示，MT1-MMP強陽性表達患者的中位生存時間為24個月，明顯短于MT1-MMP弱陽性/陰性表達患者的32個月，差異有統計學意義（P＜0.01）。MMP2強陽性表達患者的中位生存時間為24個月，明顯短于MMP2弱陽性/陰性表達患者的33個月，差異有統計學意義（P＜0.01）。提示MT1-MMP及MMP2陽性表達可能是口腔鱗狀細胞癌發展過程中的兩個分子事件，可引起患者預后不良，可能與上述基因表達異常可促進口腔鱗狀細胞癌浸潤及轉移有關。

綜上所述，口腔鱗狀細胞癌患者中MT1-MMP、MMP2的表達情況與TNM分期、分化程度、淋巴結轉移、復發及預后有關，強陽性表達患者的預后更差，MT1-MMP、MMP2對口腔鱗狀細胞癌患者的預后預測具有一定的價值。