血清中期因子、可溶性人類白細(xì)胞抗原-G 在甲狀腺癌中的診斷價(jià)值

張馳，石嵐，王培培，李月香，張?jiān)娀?/p>

北京新里程腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100161

甲狀腺癌是臨床常見的頭頸部惡性腫瘤，近年來，中國部分地區(qū)甲狀腺癌的發(fā)病率逐年增高。侵襲與轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致甲狀腺癌患者死亡的重要原因。腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤是復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程，與腫瘤基因失控以及細(xì)胞因子和其受體的相互作用關(guān)系密切[1]。中期生長因子屬于肝素結(jié)合生長因子，研究顯示，其在正常人體血清和組織中含量極少，但是在惡性腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，對(duì)于胚胎發(fā)育期細(xì)胞的生長和分化具有重要影響，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。人類白細(xì)胞抗原G屬于非經(jīng)典的組織相容性復(fù)合體Ⅰ類抗原，其異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避腫瘤的免疫監(jiān)視系統(tǒng)，在多種惡性腫瘤中的表達(dá)異常升高[2]。目前，臨床關(guān)于聯(lián)合分析中期生長因子和人類白細(xì)胞抗原G在甲狀腺癌中的表達(dá)情況及其與患者預(yù)后關(guān)系的報(bào)道較少見。因此，本研究探討中期因子（midkine，MK）、可溶性人類白細(xì)胞抗原-G（soluble human leukocyte antigen-G，sHLA-G）在甲狀腺癌中的表達(dá)水平及對(duì)其甲狀腺癌的診斷價(jià)值，以期為臨床提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年1月至2019年12月于北京新里程腫瘤醫(yī)院接受治療的89例甲狀腺癌患者和70例甲狀腺良性病變（甲狀腺腺瘤）患者，分別作為甲狀腺癌組和甲狀腺良性病變組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢查確診為甲狀腺癌或甲狀腺腺瘤；②無內(nèi)分泌治療史；③年齡≥18歲；④依從性好。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并急慢性感染；②合并肝、腎功能不全；③合并免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病及其他嚴(yán)重疾病；④入組前接受過免疫調(diào)節(jié)劑、激素類藥物等的治療。89例甲狀腺癌患者中，女74例，男15例；平均年齡為（46.67±9.87）歲；平均體重指數(shù)為（22.45±2.10）kg/m2。70例甲狀腺良性病變（甲狀腺腺瘤）患者中，女60例，男10例；平均年齡為（47.10±10.02）歲；平均體重指數(shù)為（22.23±2.06）kg/m2。另選取50例同期健康體檢者作為健康對(duì)照組，其中，女41例，男9例；平均年齡為（46.84±8.88）歲；平均體重指數(shù)為（22.50±2.19）kg/m2。3組研究對(duì)象的性別、年齡、體重指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過，所有研究對(duì)象均對(duì)本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

抽取3組研究對(duì)象的空腹靜脈血5 ml，以3000 r/min的離心速度離心10 min，分離血清，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔和空白孔，將50 μl不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本加入孔中，加入100 μl由辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體，空白孔既不加標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣品，也不加檢測抗體。封住反應(yīng)孔，在37℃恒溫箱內(nèi)放置60 min。倒掉孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，將350 μl洗滌液加滿孔內(nèi)，靜置1 min后倒掉，拍干，重復(fù)4～5次。加入底物A、B各50 μl，37 ℃避光孵育15 min。將50 μl終止液分別加入每孔，在450 nm波長下測定各孔的光密度值（optical density，OD）值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的OD值作為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。所用試劑均由上海江萊生物科技有限公司提供，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線和曲線下面積分析MK、sHLA-G對(duì)甲狀腺癌的診斷價(jià)值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組研究對(duì)象血清MK、sHLA-G水平的比較

甲狀腺癌組、甲狀腺良性病變組、健康對(duì)照組患者的血清MK、sHLA-G水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。甲狀腺癌組患者的血清MK、sHLA-G水平均高于甲狀腺良性病變組和健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；甲狀腺良性病變組患者的血清MK、sHLA-G水平均高于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 3組研究對(duì)象血清MK、sHLA-G水平的比較（±s）

表1 3組研究對(duì)象血清MK、sHLA-G水平的比較（±s）

注：a與健康對(duì)照組比較，P＜0.05；b與甲狀腺良性病變組比較，P＜0.05

組別甲狀腺癌組（n=89）甲狀腺良性病變組（n=70）健康對(duì)照組（n=50）F值P值MK（pg/ml）372.26±101.14a b 288.87±100.54a 210.01±76.64 89.944 0.000 sHLA-G（ng/ml）42.26±11.15a b 31.54±9.88a 6.87±1.22 21.064 0.000

2.2 甲狀腺癌患者的血清MK、sHLA-G水平與臨床特征的關(guān)系

TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌患者的血清MK水平均高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-2.857、2.093，P＜0.05）；腫瘤直徑≥2 cm、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌患者的血清sHLA-G水平均明顯高于腫瘤直徑＜2 cm、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-5.977、-9.895、4.217，P＜0.01）。（表2）

2.3 血清MK、sHLA-G水平對(duì)甲狀腺癌的診斷價(jià)值

血清MK、sHLA-G水平診斷甲狀腺癌的曲線下面積分別為 0.701（95%CI：0.596～0.806）和 0.804（95%CI：0.720～0.889），P＜0.05，截?cái)嘀捣謩e為301.24 pg/ml和39.79 ng/ml，靈敏度分別為62.0%和56.0%，特異度分別為76.0%和99.4%。（圖1）

3 討論

甲狀腺癌可發(fā)生于各個(gè)年齡段，一般女性的發(fā)病率高于男性，患者早期出現(xiàn)頸部緩慢增長的腫物，臨床體征不明顯，發(fā)展至晚期，腫物會(huì)對(duì)人體組織造成壓迫與侵犯，導(dǎo)致患者出現(xiàn)吞咽、呼吸和發(fā)音功能的異常，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量和生命安全[3-4]。甲狀腺腫瘤的發(fā)病因素較多，包括電離輻射、碘攝入異常以及遺傳等，因此，早發(fā)現(xiàn)、早鑒別對(duì)甲狀腺腫瘤的后期診治和預(yù)后評(píng)估具有重要意義[5]。研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤具有自主性生長、浸潤、轉(zhuǎn)移、逃避人體免疫系統(tǒng)的攻擊等特性，保持人體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)可以抑制腫瘤的發(fā)生，而組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡就會(huì)促進(jìn)惡性腫瘤表型的出現(xiàn)[6]。近年來，隨著臨床診療水平的提升，越來越多的甲狀腺疾病早期即可被診斷，但是，對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)的診斷存在較高的誤診率和漏診率，甲狀腺結(jié)節(jié)與其他甲狀腺疾病可能存在部分重疊性的影像學(xué)特征，如超聲雖然對(duì)于囊性病變的診斷準(zhǔn)確度較高，在判斷結(jié)節(jié)的大小、部位以及引導(dǎo)穿刺方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，但對(duì)結(jié)節(jié)良惡性質(zhì)的鑒別診斷價(jià)值一般[7-8]。分子生物學(xué)已經(jīng)證實(shí)各種致瘤因素均會(huì)造成局部組織細(xì)胞基因無法調(diào)控細(xì)胞正常的生長、凋亡過程，從而出現(xiàn)異常增生，影響腫瘤患者的療效和預(yù)后。腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的、多步驟的連續(xù)過程，期間會(huì)受到多種相關(guān)基因的調(diào)控，包括腫瘤轉(zhuǎn)移基因的激活、腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的失活和多種基因之間的相互作用[9]。

圖1 血清MK、sHLA-G 水平診斷甲狀腺癌的ROC曲線

本研究分析了MK、sHLA-G在甲狀腺癌中的表達(dá)情況，sHLA-G屬于非經(jīng)典的主要組織相容性復(fù)合體，可通過多種機(jī)制參與母胎免疫耐受的誘導(dǎo)與維持。有研究通過檢測發(fā)現(xiàn)，僅sHLA-G在腫瘤組織中表達(dá)，其余亞型則均未檢測到，正常人體sHLA-G主要由樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞等產(chǎn)生，通過體液循環(huán)可以存在于全身的組織器官中，發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)，保護(hù)腫瘤細(xì)胞逃逸宿主免疫監(jiān)視[10]。研究發(fā)現(xiàn)，sHLA-G一方面可以直接抑制細(xì)胞的免疫功能，阻斷效應(yīng)細(xì)胞作用的發(fā)揮；另一方面還可以通過誘導(dǎo)生成調(diào)節(jié)細(xì)胞調(diào)節(jié)人體免疫功能[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤患者腹腔積液中的sHLA-G濃度高于良性腫瘤患者腹腔積液中的sHLA-G濃度，提示sHLA-G對(duì)腫瘤的良惡性質(zhì)具有鑒別診斷意義[12]。MK是肝素結(jié)合生長因子，與器官形成關(guān)系密切，在成年組織中很少表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[13]。在細(xì)胞的表面存在對(duì)葡氨聚糖肝素和硫酸肝素具有高度親和力的多肽，MK表達(dá)異常會(huì)導(dǎo)致同細(xì)胞表面上述多肽的結(jié)合異常，導(dǎo)致惡性腫瘤生長、血管生成，同時(shí)還可以促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞的移動(dòng)，有助于腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移[14]。另外，MK的寡核苷酸反義鏈可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長和腫瘤血管的形成，小鼠直腸腫瘤與神經(jīng)母細(xì)胞瘤中均存在MK缺失，提示利用MK基因產(chǎn)物缺失并阻斷細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)可能能夠?yàn)榧谞钕賽盒阅[瘤提供了新的治療途徑，為臨床拓展新的思路與方法[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌患者的血清MK和sHLA-G水平高于甲狀腺良性病變和健康受試者，提示MK和sHLA-G在甲狀腺癌中高表達(dá)。TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌患者的血清MK、sHLA-G水平均高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌患者（P＜0.05），腫瘤直徑≥2 cm的甲狀腺癌患者的血清sHLA-G水平明顯高于腫瘤直徑＜2 cm的甲狀腺癌患者（P＜0.01），提示MK、sHLA-G水平與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，sHLA-G水平還與腫瘤直徑有關(guān)。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，血清MK、sHLA-G水平診斷甲狀腺癌的ROC曲線下面積分別為0.701和0.804，靈敏度分別為62.0%和56.0%，特異度分別為76.0%和99.4%，提示血清MK、sHLA-G水平對(duì)甲狀腺癌的診斷具有重要的意義。本研究發(fā)現(xiàn)了MK、sHLA-G的過表達(dá)與甲狀腺癌患者腫瘤直徑、惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系密切，與以往研究相似，同時(shí)通過繪制ROC曲線進(jìn)一步證實(shí)了其在甲狀腺癌診斷中的靈敏度和特異度，為臨床合理尋找診斷甲狀腺癌標(biāo)志物物提供了依據(jù)。

綜上述所，甲狀腺癌患者的血清MK、sHLA-G水平較高，與患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤直徑有一定關(guān)系；血清MK、sHLA-G水平在甲狀腺良惡性病變的鑒別診斷中有一定的應(yīng)用價(jià)值。但是，本研究納入的病例數(shù)量較少，隨訪時(shí)間短，而且對(duì)MK、sHLA-G水平與患者預(yù)后的關(guān)系未進(jìn)行分析，對(duì)具體機(jī)制和相關(guān)信號(hào)通路未進(jìn)一步闡述，故在今后的研究中，仍需要通過建立動(dòng)物模型以及開展細(xì)胞學(xué)研究深入論證。