環(huán)氧化酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義

劉東雷，吳愷，吉浩哲，兗克達(dá)，王清清

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，鄭州 450000

非小細(xì)胞肺癌是臨床常見的肺癌類型之一，發(fā)病率高，病死率增長迅速，嚴(yán)重影響患者生命安全。非小細(xì)胞肺癌占所有肺癌的75%～80%，而且由于肺癌患者早期臨床體征不明顯，肺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移具有隱匿性，對(duì)開展臨床治療產(chǎn)生了較大的影響[1]。研究顯示非小細(xì)胞肺癌具有向周圍組織浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，而且即使開展臨床治療仍具有較高的復(fù)發(fā)率。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展，越來越多的研究向分子生物學(xué)機(jī)制發(fā)展，基質(zhì)金屬蛋白酶屬于人體重要的酶類，可以特異性地降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，因此一直被認(rèn)為是腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移過程中重要的金屬蛋白酶之一；環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）則是常見的限速酶，可以催化花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)榍傲邢偎嘏c血栓素，對(duì)腫瘤微環(huán)境具有改變作用，而且在促進(jìn)腫瘤血管形成方面具有重要意義[2]。本研究分析了COX-2、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義，以期為臨床提供指導(dǎo)和依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年1月至2018年12月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的非小細(xì)胞肺癌患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理學(xué)確診為非小細(xì)胞肺癌；②術(shù)前未行放化療等抗腫瘤治療；③臨床資料保存完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入78例非小細(xì)胞肺癌患者，其中男性40例，女性38例；年齡35～81歲，中位年齡59歲。取78例患者的非小細(xì)胞肺癌組織，同時(shí)選取癌旁組織（距腫瘤邊緣＞5 cm）作為對(duì)照。

1.2 檢測方法

采用免疫組化法測定COX-2、MMP2、MMP9濃度變化，試劑均購自上海藍(lán)怡科技股份有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。制作石蠟切片，烤片待用，常規(guī)二甲苯脫蠟并水化，阻斷滅活內(nèi)源性過氧化酶，隨后進(jìn)行抗原修復(fù)，采用檸檬酸緩沖液作為抗原修復(fù)液，在切片中加入10%正常山羊血清封閉降低背景，清除血清后甩去磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），加入0.04%二氨基聯(lián)苯胺和0.03%過氧化氫溶液進(jìn)行顯色，在顯微鏡下控制染色深度，雙蒸餾水沖洗終止染色，蘇木素復(fù)染30 s，雙蒸餾水沖洗數(shù)次后進(jìn)行脫水透明，隨后在鏡下進(jìn)行觀察。

1.3 結(jié)果判斷

參照Fromowitz等[3]提出的標(biāo)準(zhǔn)，隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野讀取100個(gè)細(xì)胞，對(duì)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞（著色部位均主要為細(xì)胞質(zhì)）比例進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度：未染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞比例：＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例得分之和≥4分為陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁組織中COX-2、MMP2和MMP9陽性表達(dá)情況的比較

非小細(xì)胞肺癌組織中COX-2、MMP2和MMP9陽性表達(dá)率均明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁組織中COX-2、MMP2和MMP9陽性表達(dá)情況的比較[n（%）]

2.2 不同臨床特征非小細(xì)胞肺癌患者的非小細(xì)胞肺癌組織中COX-2、MMP2和MMP9表達(dá)情況的比較

腺癌、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、中低分化的非小細(xì)胞肺癌患者的非小細(xì)胞肺癌組織中COX-2陽性表達(dá)率分別明顯高于鱗狀細(xì)胞癌、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、高分化患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.760、13.271、21.231，P＜0.01）；TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌患者的非小細(xì)胞肺癌組織中MMP2陽性表達(dá)率分別明顯高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.371、18.992、12.570，P＜0.01）；TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌患者的非小細(xì)胞肺癌組織中MMP9陽性表達(dá)率分別高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.144、7.025、6.947，P＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征非小細(xì)胞肺癌患者的非小細(xì)胞肺癌組織中COX-2、MMP2和MMP9的表達(dá)情況（n=78）

2.3 相關(guān)性分析

COX-2與 MMP2、MMP9表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.321、0.243，P＜0.05），MMP2與MMP9表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.448，P＜0.05）。

3 討論

非小細(xì)胞肺癌屬于臨床常見的肺部惡性腫瘤，目前發(fā)病率和病死率均位居榜首，近年來發(fā)病率呈逐年升高趨勢，已成為威脅人類身心健康的重要問題之一。肺癌具有發(fā)病隱匿、侵襲性高等特點(diǎn)，因此早期診斷對(duì)降低肺癌病死率具有至關(guān)重要的意義。目前臨床診斷肺癌的方法較多，包括臨床癥狀檢查、影像學(xué)檢查、組織病理檢查以及腫瘤標(biāo)志物檢測等方法，但是多數(shù)患者早期臨床癥狀不明顯，因此單純依靠臨床癥狀不具有特異性；影像學(xué)檢查可以反映腫瘤病灶的大小和變化，但是無法對(duì)腫瘤細(xì)胞活動(dòng)進(jìn)行顯現(xiàn)，而且在微小病灶的檢出上效果一般[4]；病理學(xué)檢查一直是臨床肺癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，特異度較高，但是具有創(chuàng)傷性，而且受到組織類型以及標(biāo)本留取等多種因素影響，患者常無法接受，在早期診斷和評(píng)價(jià)治療效果方面具有局限性[5]。近年來隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的飛速發(fā)展，在分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在癌變以及發(fā)生發(fā)展過程中會(huì)分泌活性物質(zhì)，主要存在于肺癌組織和體液中，通過技術(shù)手段檢測其在腫瘤患者體內(nèi)的含量可評(píng)價(jià)患者治療效果，為早期診斷和評(píng)估預(yù)后奠定了基礎(chǔ)[6]。研究發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌患者存在明顯的個(gè)體性差異，因此近年來個(gè)體化治療根據(jù)肺癌患者藥理學(xué)以及基因?qū)W特點(diǎn)采用最佳治療方法，提升臨床療效，延長患者生存時(shí)間，分子生物學(xué)標(biāo)志物的應(yīng)用可以評(píng)估患者治療后是否具有更高的復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險(xiǎn)，為臨床調(diào)整治療方法奠定了基礎(chǔ)[7]。近年來尋找診斷肺癌的特異性標(biāo)志物是臨床研究的熱點(diǎn)，大量研究證實(shí)細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用，凋亡是人體正常細(xì)胞維持穩(wěn)定的重要保護(hù)機(jī)制，細(xì)胞凋亡參與了人體器官發(fā)育以及功能維持，腫瘤的發(fā)生則正是細(xì)胞凋亡紊亂導(dǎo)致，細(xì)胞凋亡過程被抑制以及基因的改變?cè)斐杉?xì)胞轉(zhuǎn)化突變，最終演變成為惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展[8]。

本研究觀察了COX-2、MMP2、MMP9在非小細(xì)胞肺癌患者體內(nèi)的變化情況，環(huán)氧化酶屬于分解花生四烯酸形成內(nèi)源性前列腺素的限速酶，對(duì)于腫瘤多種生物學(xué)行為具有調(diào)控作用，COX-2屬于重要的同功酶之一，一般在靜息狀態(tài)下不表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞被各種因子刺激時(shí)會(huì)快速合成，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展等病理過程，最早在1998年有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)利用免疫組化法在非典型性腺瘤樣增生組織及腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)COX-2蛋白表達(dá)明顯增加[9]。目前大量研究證實(shí)一方面COX-2能夠促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞增殖，同時(shí)還可以抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[10]；另一方面COX-2可以促進(jìn)惡性腫瘤血管形成，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，還可以參與致癌物質(zhì)代謝過程[11]。還有學(xué)者指出COX-2在腫瘤新生血管和轉(zhuǎn)移病灶的血管中均表達(dá)，可以通過人體多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上調(diào)體內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，促進(jìn)了淋巴血管形成，還可以通過增加血管源性趨化性細(xì)胞因子表達(dá)促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌發(fā)生和發(fā)展[12]。隨著分子生物學(xué)的研究進(jìn)展，細(xì)胞外基質(zhì)變化與調(diào)節(jié)作用在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中也越來越受到關(guān)注，細(xì)胞外基質(zhì)分泌后在基底膜與細(xì)胞間質(zhì)之間構(gòu)成網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，可以為腫瘤的形成和發(fā)展提供組織保障，因此越來越多的研究關(guān)注基質(zhì)成分變化，以指導(dǎo)臨床診斷和治療，基質(zhì)金屬蛋白酶家族在腫瘤生長過程中發(fā)揮著重要作用[13]。基質(zhì)金屬蛋白酶為鈣離子、鋅離子依賴性蛋白質(zhì)水解酶，可以破壞細(xì)胞微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，破壞人體防御腫瘤侵犯的天然屏障，因此在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用[14]。MMP9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員之一，有研究指出基底膜腫瘤穿透基底膜、穿透血管的全過程均需要基質(zhì)金屬蛋白酶參與，其激活過程極為復(fù)雜，通過打破基質(zhì)金屬蛋白酶與其抑制因子之間的平衡關(guān)系發(fā)揮作用。一方面MMP9可以對(duì)膠原進(jìn)行降解，激活其他類型基質(zhì)金屬蛋白酶，參與基質(zhì)降解過程，促進(jìn)了腫瘤生長，另一方面MMP9可以改建細(xì)胞外基質(zhì)，破壞正常的基底膜結(jié)構(gòu)導(dǎo)致腫瘤血管形成，因此在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要作用。MMP2也是重要的Ⅳ型膠原酶，能夠選擇性降解基底膜的主要成分Ⅳ型膠原，其分布廣泛，在組織與細(xì)胞出現(xiàn)癌變時(shí)表達(dá)明顯升高，其分解Ⅳ型膠原酶過多會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，而且其在肺癌組織中過度表達(dá)與患者病理分型、分化情況以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要的作用[15]。

本研究結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌組織中COX-2、MMP2和MMP9陽性表達(dá)率均明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明在非小細(xì)胞肺癌中存在COX-2、MMP2和MMP9高表達(dá)。TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌患者的非小細(xì)胞肺癌組織中MMP2、MMP9陽性表達(dá)率分別高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，說明MMP2和MMP9在不同臨床分期、分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面存在差異性；腺癌、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、中低分化的非小細(xì)胞肺癌患者的非小細(xì)胞肺癌組織中COX-2陽性表達(dá)率分別明顯高于鱗狀細(xì)胞癌、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、高分化患者，說明COX-2在不同腫瘤類型、臨床分期、分化程度方面存在差異性。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，COX-2與MMP2、MMP9表達(dá)呈正相關(guān)，MMP2與MMP9表達(dá)呈正相關(guān)，說明三者在非小細(xì)胞肺癌患者表達(dá)中存在相關(guān)性。本研究優(yōu)勢在于證實(shí)了非小細(xì)胞肺癌患者體內(nèi)存在COX-2、MMP2和MMP9過表達(dá)，為臨床開展早期診斷和評(píng)估肺癌患者臨床分期、腫瘤類型、轉(zhuǎn)移情況、分化程度提供了一定的依據(jù)，但是本研究納入患者數(shù)量有限，隨訪時(shí)間短，因此還需要開展多中心、大樣本量、長期隨訪深入研究。

綜上所述，非小細(xì)胞肺癌組織中COX-2、MMP2和MMP9表達(dá)明顯升高，與臨床特征有一定關(guān)系，三者間表達(dá)存在相關(guān)性。