冠突散囊菌繁殖體提取物抑菌活性研究

肖晗汕，李滔滔*，湯涵，陳怡，汪無(wú)忌，劉純，胡治遠(yuǎn)，余松林，文瑞明，劉石泉

1(湖南城市學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 益陽(yáng)，413000)2(黑茶金花湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖南城市學(xué)院)，湖南 益陽(yáng)，413000)

冠突散囊菌[1-2]又稱金花菌，因其在茯磚茶中可形成顆粒飽滿的子囊果[3-5]，類似金花而得名。冠突散囊菌的生長(zhǎng)狀況是評(píng)價(jià)茯磚茶品質(zhì)的理化指標(biāo)之一，已列入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。且前研究表明，茯磚茶具有多種功效，包括抗氧化、降血脂和降血糖等[6-11]。在茯磚茶發(fā)花過(guò)程中，冠突散囊菌大量生長(zhǎng)[12-14]，其他微生物受到一定的抑制，提示冠突囊菌在生長(zhǎng)階段產(chǎn)生具有抑菌活性的物質(zhì)；同時(shí)長(zhǎng)期保存的茯磚茶較少出現(xiàn)雜菌污染的情況，提示茯磚茶中的金花可持續(xù)提供抑菌物質(zhì)。目前已證實(shí)金花菌發(fā)酵液有一定的抑菌活性[15-16]，其提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏桿菌、枯草芽孢桿菌與白色鏈霉菌有抑制作用?，F(xiàn)有文獻(xiàn)大都集中在金花菌發(fā)酵液和茯磚茶[17-20]的抑菌效果研究，但對(duì)冠突散囊菌的繁殖體(子囊果、子囊孢子和分生孢子)提取物抑菌活性的研究較少。本論文采用玻璃珠振搖法破碎金花菌繁殖體，獲得相應(yīng)提取物，探討其對(duì)金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色鏈霉菌和白色念珠菌的抑菌活性，同時(shí)為茯磚茶較難染菌，金花菌天然抗菌劑的開(kāi)發(fā)和利用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 菌種來(lái)源

冠突散囊菌(JH1205)由黑茶金花湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 設(shè)備與試劑

BBS-DDC超凈工作臺(tái)，山東博科；HWS-100F恒溫培養(yǎng)箱，上海丙林；R-3001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長(zhǎng)城科工；YKW-303臺(tái)式恒溫振蕩器，上海程造；BKQ-Z30I立式壓力蒸汽滅菌鍋，山東博科。

瓊脂(不含抗生素)、蔗糖、NaCl、蛋白胨、土豆等(除蛋白胨，土豆外均為分析純)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 冠突散囊菌中子囊果與分生孢子的獲得

子囊果的獲得：分別將制備好的金花散茶和儲(chǔ)存6年的金花散茶過(guò)100目篩，篩選分離獲得。

參照劉作易等的研究[21]，微調(diào)冠突散囊菌產(chǎn)分生孢子的條件，在高滲液體培養(yǎng)基中接種金花菌孢子懸液，于36 ℃靜置培養(yǎng)4 d，再用無(wú)菌水沖洗菌膜上的分生孢子，獲得冠突散囊菌分生孢子懸液；高滲培養(yǎng)基為添加10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl和20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))蔗糖的PDA培養(yǎng)基。

1.3.2 冠突散囊菌中子囊果、子囊孢子與分生孢子中抑菌物質(zhì)的提取

子囊果中抑菌物質(zhì)的提?。悍Q2 g子囊果裝入錐形瓶中，加30 mL 蒸餾水和玻璃珠若干(玻璃珠鋪滿瓶底)，置于180 r/min搖床中振搖120 min。將破碎后的子囊果溶液在4 000 r/min的條件下離心10 min，保留上清液(此為子囊果提取物)；將沉淀物用蒸餾水清洗后，加蒸餾水溶解制成懸濁液，再用4層紗布過(guò)濾獲得子囊孢子懸濁液，調(diào)節(jié)子囊孢子濃度為10-7個(gè)/mL，加入玻璃珠后置于-18 ℃冰箱冷凍1 d，再60 ℃水浴加熱1.5 h，取出置于180 r/min搖床中振搖10 h，4 000 r/min離心10 min，保留上清液(此為子囊孢子提取物)。

分生孢子中抑菌活性物質(zhì)的提?。禾崛》椒ê妥幽益咦又谢钚晕镔|(zhì)的提取一致。

所有提取物濃縮至100 mg/mL進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 抑菌實(shí)驗(yàn)

將滅菌后的濾紙片浸入濃縮后的提取物中，浸泡15 min，瀝干，置于涂布有0.3 mL供試菌(新鮮培養(yǎng)菌種，OD值為0.4)的BL(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)平板中，恒溫培養(yǎng)24 h后測(cè)量抑菌圈的大小，平行測(cè)定3次。供試菌為金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌，此4種菌培養(yǎng)溫度為37 ℃；白色念珠菌和白色鏈霉菌，此2種菌培養(yǎng)溫度為30 ℃。

1.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

1.3.4.1 溫度穩(wěn)定性

取適量子囊果提取物，分別置于室溫(25 ℃)、40、60、80、100、121 ℃下分別處理1 h，冷卻至室溫后，以未處理的樣品為對(duì)照，以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為供試菌，用1.3.3中方法驗(yàn)證其抑菌活性的變化，每個(gè)處理重復(fù)3次，將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后測(cè)量抑菌圈半徑。

1.3.4.2 pH值穩(wěn)定性

取適量子囊果提取物，采用1 mol/L HCl溶液和NaOH溶液分別調(diào)pH值至2、4、6、8、10，放置2 h，以未處理的樣品為對(duì)照，以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為供試菌，用1.3.3方法驗(yàn)證其抑菌活性的變化，每個(gè)處理重復(fù)3次，將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后測(cè)量抑菌圈半徑。

1.3.4.3 紫外光穩(wěn)定性

取適量子囊果提取物，置于30 W紫外燈下，距離30 cm，照射發(fā)酵液濃縮液1、2、3、4、5 h，以未處理的樣品為對(duì)照，以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為供試菌，用1.3.3中方法驗(yàn)證其抑菌活性的變化，每個(gè)處理重復(fù)3次，將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后測(cè)量抑菌圈半徑。

1.3.5 冠突散囊菌子囊果提取物不同濃度下的抑菌實(shí)驗(yàn)

按1.3.3中所述實(shí)驗(yàn)方法，將浸泡不同濃度子囊果提取物的濾紙片，置于涂布有0.3 mL供試菌的BL培養(yǎng)基平板中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后測(cè)量抑菌圈的大小，平行測(cè)定3次。供試菌為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 冠突散囊菌觀察

按1.3.1中實(shí)驗(yàn)方案分離得到冠突散囊菌的子囊果、子囊孢子和分生孢子，并進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖1所示。冠突散囊菌的繁殖方式分為無(wú)性繁殖和有性繁殖2種方式，有性繁殖時(shí)產(chǎn)生大量黃色閉囊殼(子囊果)，外表纏繞有大量營(yíng)養(yǎng)菌絲，子囊果破裂，釋放子囊孢子；無(wú)性繁殖時(shí)只產(chǎn)生分生孢子。在普通培養(yǎng)基中，冠突散囊菌進(jìn)行有性繁殖，形成表面粗糙而致密的金黃色菌膜(圖1-a)；在高滲液體培養(yǎng)基中，冠突散囊菌進(jìn)行無(wú)性繁殖，生成緊致而細(xì)密的灰白色菌膜，表面相對(duì)有性型較為光滑(圖1-b)。冠突散囊菌在茶葉基質(zhì)中，以有性繁殖為主，在茶葉基質(zhì)表面形成大量的金黃色顆粒，此為冠突散囊菌的子囊果(圖1-c)。從液體培養(yǎng)基上的菌膜顏色，即可區(qū)分冠突散囊菌的繁殖方式。光鏡觀察下，子囊孢子與分生孢子形態(tài)基本一致，均為球形或橢球形(圖1-d、圖1-e)。

a-有性菌體(子囊果);b-無(wú)性菌體(分生孢子);c-長(zhǎng)滿子囊果的散茶;d-光鏡下子囊孢子;e-光鏡下分生孢子圖1 冠突散囊菌不同繁殖體圖片F(xiàn)ig.1 The picture of eurotium cristatum propagule

2.2 冠突散囊菌子囊果、子囊孢子和分生孢子提取物的抑菌活性

由表1可知，冠突散囊菌的無(wú)性繁殖體和有性繁殖體的提取物表現(xiàn)出截然不同的抑菌活性，無(wú)性繁殖體(分生孢子)提取物對(duì)6種供試菌均未檢測(cè)到抑菌活性，而有性繁殖體子囊果和子囊孢子提取物，具有明顯的抑菌活性。子囊果提取物和子囊孢子提取物對(duì)6種供試菌的抑菌能力有所差別，其中子囊果提取物的抑菌效果更好，例如子囊果提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌全半徑最大可達(dá)到5.8 mm，子囊孢子對(duì)其抑菌圈半徑為2.7 mm。

表1 子囊果、子囊孢子及分生孢子提取物對(duì)供試菌的抑菌圈半徑 單位：mm

子囊果和子囊孢子提取物對(duì)不同微生物的抑制作用有很大區(qū)別，對(duì)金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、白色鏈霉菌和大腸桿菌的抑制效果最好；對(duì)枯草芽孢桿菌和白色念珠菌的抑制效果較弱。金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌和枯草芽孢桿菌均為革蘭氏陽(yáng)性菌，枯草芽孢桿菌的抑菌圈半徑最大為0.9 mm，而金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌的抑菌圈半徑最大為5.8 mm；大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，其最大抑菌圈半徑可達(dá)5.8 mm，這說(shuō)明子囊果和子囊孢子提取物的抑菌作用不依賴于微生物細(xì)胞壁的組成。

冠突散囊菌子囊果儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)其抑菌活性有顯著影響。隨著儲(chǔ)存時(shí)間(6年)的延長(zhǎng)，子囊孢子提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌和大腸桿菌的抑制作用基本不變，但對(duì)白色鏈霉菌的抑制作用增強(qiáng)了2倍(抑菌圈半徑從2.2 mm增加至4.5 mm)，對(duì)枯草芽孢桿菌和白色念珠菌的抑制作用則消失。除了白色念珠菌，陳年子囊果的提取物對(duì)其余5種供試菌的抑菌活性均比新鮮子囊果提取物的抑菌活性更強(qiáng)，這說(shuō)明在長(zhǎng)時(shí)間的儲(chǔ)存過(guò)程中，子囊果中積累了更多或更有效的抑菌活性物質(zhì)。

2.3 冠突散囊菌子囊果中抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性

2.3.1 熱穩(wěn)定性

由表2可知，經(jīng)不同溫度處理的金花菌子囊果提取物仍對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有抑制作用；隨著處理溫度的升高，其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用逐漸降低，且降低幅度較大，當(dāng)121 ℃處理1 h后，其抑菌圈半徑從6.0 mm降低到1.5 mm，降低幅度為75%。隨著溫度的升高，子囊果提取物對(duì)大腸桿菌的抑制作用也有所降低，但相對(duì)于金黃色葡萄球菌，其降低幅度更小(抑菌圈半徑從4.7 mm降低到2.4 mm，降低幅度為49%)，這說(shuō)明金花菌子囊果中可抑制大腸桿菌的物質(zhì)具有更好的熱穩(wěn)定性。

表2 金花菌子囊果提取物的熱穩(wěn)定性 單位：mm

2.3.2 酸堿穩(wěn)定性

金花菌子囊果提取物初始 pH值為6，其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為5.7 mm，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為3.5 mm，由表3可知，經(jīng)過(guò)不同pH值的酸堿處理后，金花菌子囊果提取物仍對(duì)大腸桿菌有抑制作用；僅在酸性條件下，對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用。pH值為4 時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑均為最大，說(shuō)明在pH 值低于原液的酸性條件下，其中的抑菌物質(zhì)作用隨pH 值降低而明顯增強(qiáng)。金花菌子囊果提取物中對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用的物質(zhì)具有一定的耐酸能力，耐堿能力弱。

表3 金花菌子囊果提取物的酸堿穩(wěn)定性 單位：mm

pH為2的子囊果提取物對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為對(duì)照組的1.29倍，pH為4的子囊果提取物對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為對(duì)照組的1.34 倍，說(shuō)明在pH 值低于原液的酸性條件下，其中對(duì)大腸桿菌的抑菌物質(zhì)作用有所增強(qiáng)，當(dāng)pH 值<4 時(shí)，抑菌作用亦隨pH 值降低而減弱；在堿性條件下，其抑菌作用減弱，由此可見(jiàn)，金花菌子囊果提取物中對(duì)大腸桿菌有抑制作用的物質(zhì)具有一定的耐酸堿能力，有較強(qiáng)的耐酸能力。

2.3.3 紫外光穩(wěn)定性

由表4可知，金花菌子囊果提取物經(jīng)過(guò)不同時(shí)間紫外光照射后，其對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用的變化有所不同。對(duì)于金黃色葡萄球菌，在紫外線照射子囊果提取物2 h后，其抑菌活性開(kāi)始下降，但隨著照射時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)至5 h，其抑菌活性無(wú)明顯的降低，表明子囊果提取物中能抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的物質(zhì)具有一定的紫外線穩(wěn)定性。

表4 金花菌子囊果提取物的紫外光穩(wěn)定性 單位：mm

對(duì)于大腸桿菌，在紫外線照射子囊果提取物4 h后，其抑菌活性開(kāi)始下降，再繼續(xù)延長(zhǎng)照射時(shí)間至5 h，其抑菌活性基本不變，表明子囊果提取物中能抑制大腸桿菌生長(zhǎng)的物質(zhì)比抑制黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的物質(zhì)，具有更好的紫外線穩(wěn)定性。

2.3.4 冠突散囊菌子囊果提取物不同質(zhì)量濃度下的抑菌效果

圖2為冠突散囊菌子囊果提取物不同質(zhì)量濃度時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用，由圖2可知，隨著提取物質(zhì)量濃度的降低，所測(cè)得抑菌圈半徑越來(lái)越小，說(shuō)明抑菌效果越來(lái)越差。當(dāng)提取物質(zhì)量濃度降低至20 mg/mL，抑菌圈消失，這說(shuō)明用冠突散囊菌子囊果提取物做抑菌劑時(shí)，需調(diào)節(jié)其質(zhì)量濃度>20 mg/mL。

圖2 冠突散囊菌子囊果提取物對(duì)金黃色葡萄糖球菌和大腸桿菌的抑菌圈半徑Fig.2 The radius of inhibition cycle of Eurotium cristatum extract on Escherichia coli and Staphylococcus aureus

3 結(jié)論

本文研究了冠突散囊菌繁殖體中提取物質(zhì)的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)其有性繁殖體(子囊果和子囊孢子)提取物對(duì)細(xì)菌、真菌、放線菌有抑制作用，其中對(duì)金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌和大腸桿菌的抑制效果最好；無(wú)性繁殖體(分生孢子)提取物未檢測(cè)到抑菌活性。子囊果提取物的抑菌活性強(qiáng)于子囊孢子提取物；隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加，子囊果中提取物的抑菌活性得到增強(qiáng)，子囊孢子中提取物的抑菌活性基本不變。研究還表明，抑菌物質(zhì)有良好的紫外線穩(wěn)定性和一定的熱穩(wěn)定性，在酸性條件下抑菌物質(zhì)的抑菌活性保持不變，甚至增強(qiáng)，這有利于抑菌物質(zhì)添加在果汁等酸性飲料中，有利于用于酸性飲料的冠突散囊菌天然防腐劑應(yīng)用開(kāi)發(fā)。