護色劑對調味魚殺菌過程中護色效果及美拉德反應的影響

齊慧林，楊方，余達威，劉曉麗，姜啟興，許艷順，于沛沛，夏文水

(江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室、食品學院，江蘇省食品安全與質量控制協同創新中心，江蘇 無錫，214122)

鳀魚(Engraulisjapanicus)是一種小型中上層低值魚類，平均體長約8～12 cm，在我國的東海區、黃海區資源豐富。鳀魚營養價值較高，但其個體小，容易腐爛，不適合鮮食，捕撈后常制成魚干，后加工成調味魚制品[1]。殺菌工藝對調味魚制品是必要的，可以保證產品的安全性并使其具有一定的貨架期，但高溫條件下發生的褐變反應，影響調味魚的感官品質。

美拉德反應是食品加工過程中廣泛存在的一種非酶褐變反應，是游離氨基酸，肽或蛋白質的氨基與還原糖的羰基之間的復雜反應，最終生成黑色素[2]。調味魚制品由于含有豐富的蛋白質、氨基酸和糖類，高溫殺菌過程中容易發生美拉德反應，導致魚肉制品顏色加深。添加褐變抑制劑是食品工業中抑制褐變最廣泛采用的方法，可以通過添加活性氨基物質、有機酸、抗氧化劑等對食品中的美拉德反應進行控制，減緩反應帶來的不必要的顏色變化[3]。半胱氨酸是含有巰基的氨基酸，可以抑制食品中的多種褐變反應，在罐頭、飲料以及鮮切果蔬類食品中均有應用[4]。檸檬酸是食品工業中常用的酸化劑和螯合劑，減緩飲料及罐頭類食品中的美拉德等褐變反應[5]。D-異抗壞血酸鈉是穩定性較高的天然抗氧化劑，常用作休閑肉制品的護色劑[6]。王進勉[7]的研究表明檸檬酸可以抑制魷魚絲浸提液的褐變反應。黃梅桂[8]的研究表明半胱氨酸可以顯著抑制大豆肽美拉德反應體系的顏色，適量的VC對美拉德褐變也有一定的抑制作用。

因此，本實驗以調味鳀魚為研究對象，通過添加L-半胱氨酸、檸檬酸、D-異抗壞血酸鈉3種護色劑對殺菌過程中的顏色變化進行控制。利用A420、A294、熒光強度表征美拉德反應程度，結合pH、還原糖、5-HMF指標的分析，以期闡明護色劑對殺菌后改善調味魚顏色的原因，為調味水產食品的褐變控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鳀魚干原料購于無錫天蓬食品城，質量(2.0±0.5) g，體長(5.0±1.0) cm，水分含量44%；

三氯乙酸、無水乙醇、草酸、2-硫代巴比妥酸、葡萄糖、5-HMF均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

L-半胱氨酸、檸檬酸、D-異抗壞血酸鈉均為食品級，浙江一諾生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LE438 pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司；UltraScan Pro1166高精度分光測色儀，美國Hunterlab公司； UV-1800紫外可見分光光度計，日本島津公司；Waters 1525EF 高效液相色譜儀-示差折光檢測器，美國Waters公司；F-7000熒光分光光度計，日本Hitachi公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 實驗設計

根據GB 2760—2014，L-半胱氨酸、檸檬酸、D-異抗壞血酸鈉可在各類食品中按需添加。參考王進勉[7]、黃梅桂[8]的研究結果，確定護色劑的添加量均為0.1%～0.5%(質量分數)。添加護色劑到拌料魚中，用高聚合尼龍復合聚乙烯袋真空封口，110 ℃，35 min殺菌后取樣，-20 ℃冰箱保存。對樣品的色差、pH、還原糖和5-HMF含量、熒光強度、A294、A420的變化進行測定分析。

1.3.2 色差分析

采用高精度分光測色儀對調味魚表面的亮度(L*)、紅度(a*)、黃度(b*)值進行測定。再根據公式(1)計算總色差ΔE[9]：

(1)

式中：L*，亮度；a*，紅度；b*，黃度。

1.3.3 pH值的測定

參照GB 5009.237—2016。

1.3.4 還原糖的測定

參照GENG等[10]的方法并加以改進。將2.5 g攪碎的樣品用10 mL無水乙醇均質，然后在4 ℃，1 000×g下離心5 min。用5 mL 80%(體積分數)乙醇水溶液重復萃取3次，合并上清液并用雙層濾紙過濾。

提取液通過0.45 μm濾膜，通過HPLC分析。使用條件為：色譜柱：Waters Sugar-pak1 6.5 mm×300 mm；柱溫：40 ℃；檢測：示差折光檢測器；進樣體積：15 μL；流動相：0.1 mol/L NaNO3；流速：0.3 mL/min。

1.3.5 5-HMF的測定

參照LAMBERTS等[11]的方法并加以改進。將2 g攪碎的樣品用9 mL 0.15 mol/L的草酸溶液均質，振蕩提取30 min，與6 mL 40%(體積分數)三氯乙酸溶液混合，靜置10 min。在4 ℃，4 000×g下離心15 min，取4 mL上清液與1 mL 0.05 mol/L 2-硫代巴比妥酸溶液混合，40 ℃水浴30 min，冷卻后測定443 nm處吸光值。

1.3.6 吸光值的測定

參照GENG等[12]的方法并加以改進。將3 g攪碎的樣品用10 mL預冷的去離子水均質，然后與10 mL冷的20%三氯乙酸溶液勻漿混合。將混合物在 4 ℃，10 000×g下離心10 min，提取液用濾紙過濾后測定熒光強度(激發波長370 nm；發射波長440 nm)及在294 nm、420 nm處吸光值。

1.3.7 數據處理

色差測定重復5次，其余實驗重復3次，取平均值。采用SPSS 22.0對數據進行統計分析，采用Duncan’s多重分析進行組間顯著性檢驗，P<0.05表示差異顯著。并用Origin 9.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 護色劑對調味魚顏色變化的影響

由表1可知，殺菌后，調味魚的L*、a*、b*、ΔE值分別下降了12.4%、26.3%、28.6%、17.7%，整體顏色變暗，這與TANG等[13]的研究結果一致。魚罐頭中含有的糖類和蛋白質在殺菌過程中因受熱發生美拉德反應，造成L*值的降低，調味魚顏色變暗。a*和b*值的降低可能是調味魚中色素降解等因素與美拉德反應綜合作用的結果[13]。

表1 殺菌過程對調味魚顏色變化及美拉德反應關聯值的影響Table 1 Effect of sterilization process on color change and correlation value of Maillard reaction of seasoned fish

由表2可知，隨著L-半胱氨酸添加量的增加，調味魚的L*、a*、b*、ΔE值先增加后趨于平穩，相比于空白組均有顯著提高(P<0.05)，這與WEI等[14]的研究結果一致。添加檸檬酸后，調味魚的L*、b*、ΔE值相比于空白組有顯著提高，但a*值沒有顯著性差異。添加D-異抗壞血酸鈉后，調味魚的L*、ΔE值相比于空白組有顯著提高，但不同添加量之間沒有顯著性差異，a*、b*值與空白組沒有顯著性差異。由此可見，適量添加3種護色劑可以提高殺菌后調味魚的整體明亮度。以總色差為依據，L-半胱氨酸、檸檬酸、D-異抗壞血酸鈉的最適添加量(質量分數)分別為0.3%、0.4%、0.1%。整體來看，半胱氨酸作為護色劑的效果最好。

表2 不同添加量的護色劑對殺菌后調味魚顏色變化的影響Table 2 Effect of color protectant on color change of seasoned fish after sterilization

2.2 pH值的變化

pH是美拉德反應的重要影響因素，主要作用于美拉德反應初始階段的羰氨縮合和高級階段Amadori產物的降解。pH在3～10時，美拉德反應速率隨著pH的增加而增加。pH通過影響還原糖的結構以改變其美拉德反應性。當pH≤7時，Amadori產物更容易發生1,2-烯醇化反應[15-16]。由表1和圖1可知，殺菌后調味魚體系pH幾乎不變，在5.9左右，呈微酸性。半胱氨酸的加入對體系的pH影響不大，添加D-異抗壞血酸鈉使pH略有升高。隨著檸檬酸添加量的增加，調味魚pH呈線性降低，體系pH從5.87降至5.50。

圖1 不同添加量的護色劑對殺菌后調味魚pH的影響Fig.1 Effect of color protectant on pH of seasoned fish after sterilization

2.3 護色劑對調味魚還原糖含量的影響

還原糖是美拉德反應的羰基供體，高溫殺菌過程中引起其含量變化的反應主要有多糖水解、已糖脫水及美拉德反應[15, 17]。由表1可知，調味魚中主要的還原糖是葡萄糖和果糖，且葡萄糖含量高于果糖。殺菌后葡萄糖含量降低了44.4%，果糖含量幾乎不變。由于醛糖容易形成Amadori重排產物，褐變速度快；酮糖更易形成Heyns重排產物，褐變速度相對較慢，且調味魚中葡萄糖含量高，所以，殺菌過程中參與美拉德褐變的還原糖主要是葡萄糖。由圖2可知，隨著L-半胱氨酸添加量的增加，葡萄糖含量先增加后迅速降低，各添加量均顯著高于空白組(P<0.05)。果糖含量相比葡萄糖變化幅度較小。有研究表明，氨基酸促進了多糖的水解，造成還原糖含量的增加[2]。同時半胱氨酸作為還原性氨基酸，可能低添加量時，主要與Amadori產物反應，不會引起還原糖的額外消耗；過量的半胱氨酸會作為初始反應物消耗還原糖，導致葡萄糖含量的減少[8, 18]。隨著檸檬酸添加量的增加，葡萄糖含量先平穩再增加至顯著高于空白組。果糖含量先穩定后略增加。美拉德初始階段可逆，酸促進羰氨縮合產物的解離，而且酸減少了還原糖的開鏈式結構，降低了糖的反應性，從而減少還原糖的利用，造成還原糖含量的增加[16, 19]。隨著D-異抗壞血酸鈉添加量的增加，葡萄糖含量先增加后趨于平穩，各添加量均顯著高于空白組。果糖含量變化幅度較小。D-異抗壞血酸鈉可以清除美拉德反應中的自由基，并且可以和中間產物反應，抑制美拉德反應的進行；同時部分以其異構體抗壞血酸形式存在，抗壞血酸的性質類似于糖，但不需要氨基即可發生自氧化，產物可進入美拉德反應，減少葡萄糖的消耗[19-20]。葡萄糖含量及美拉德反應活性高，所以護色劑的添加主要引起了葡萄糖含量的變化。果糖含量及反應活性相對較低，變化幅度較小。但果糖的美拉德反應常伴隨著果糖的焦糖化，可能會造成果糖的消耗[17]。

a-葡萄糖含量;b-果糖含量圖2 不同添加量的護色劑對殺菌后調味魚葡萄糖和果糖含量的影響Fig.2 Effect of color protectant on glucose and fructose content of seasoned fish after sterilization

2.4 護色劑對調味魚5-HMF含量的影響

5-HMF是一種具有呋喃環的糠醛化合物，是美拉德反應高級階段的重要產物，同時是已糖脫水和抗壞血酸氧化的共同產物[21]。在美拉德反應中主要由Amadori產物通過1，2-烯醇化途徑生成，果糖在酸性環境中脫水可直接生成5-HMF，而葡萄糖需先轉化為果糖再進行脫水反應[22]。由表1可知，殺菌后，5-HMF含量增加了47.4%，表明調味魚中積累了一定量的美拉德中間產物。隨著L-半胱氨酸添加量的增加，5-HMF的含量先降低后緩慢增加，各添加量均顯著低于空白組(P<0.05)。由圖3可知，半胱氨酸可以和其他氨基酸的Amadori產物反應，進而阻止其通過1，2-烯醇化途徑生成5-HMF。添加量過高時，可能會形成自身的Amadori產物，造成5-HMF的積累，但半胱氨酸相比于其他氨基酸生成的5-HMF含量較低[8, 23]。隨著檸檬酸添加量的增加，5-HMF含量先迅速降低后緩慢增加至與空白組持平。酸可以促進羰氨縮合產物N-葡萄糖胺水解，減少進一步生成5-HMF；但使更大比例的Amadori產物通過1，2-烯醇化途徑生成5-HMF，且果糖可直接脫水生成5-HMF，可能造成了5-HMF的增加[7, 22]。隨著D-異抗壞血酸鈉添加量的增加，5-HMF含量先迅速降低再增加至顯著高于空白組。可能低添加量時，還原作用占主導，抑制美拉德反應。高添加量時，在密封包裝的缺氧條件下，抗壞血酸與水反應生成2,3-二酮古洛糖酸，再進一步脫羧脫水生成呋喃醛等物質，造成5-HMF含量的持續增加[21]。

圖3 不同添加量的護色劑對殺菌后調味魚5-HMF含量的影響Fig.3 Effect of color protectant on 5-HMF content of seasoned fish after sterilization

2.5 護色劑對調味魚美拉德反應程度的影響

熒光物質主要由還原性化合物重組或氨基化合物Strecker降解形成，反映了美拉德反應的早期過程[16]。由表1可知，殺菌后熒光強度增加了38.7%，表明美拉德反應中間產物的積累。隨著L-半胱氨酸添加量的增加，熒光強度降低后趨于平穩，各添加量均顯著低于空白組(P<0.05)。半胱氨酸作用于Amadori產物，阻止其進一步生成脫氧還原酮及環化，從而影響熒光化合物的產生[8]。隨著檸檬酸添加量的增加，熒光強度下降至顯著低于空白組后緩慢回升。酸抑制了美拉德反應初始階段的羰氨縮合，并使Amadori產物更易發生1，2-烯醇化，減少2，3-烯醇化途徑生成的還原酮類物質，從而影響熒光強度，這與GENG等[12]的研究結果相似。隨著D-異抗壞血酸鈉添加量的增加，熒光強度先降低后持續增加至顯著高于空白組。可能是低濃度的異抗壞血酸鈉還原作用占主導，而高濃度時自身氧化促進了美拉德反應，導致熒光強度的增加。這與劉紅[24]的研究結論相似，其研究表明美拉德反應產物的熒光強度隨著抗氧化劑濃度的增加而增加。

在波長294 nm處的吸光值與美拉德反應過程中產生的無色中間產物有關，如糖、醛、小分子酮等[15]。由表1可知，殺菌后A294略有增加。隨著L-半胱氨酸添加量的增加，A294降低后趨于平穩，且均顯著低于空白組(P<0.05)。半胱氨酸具有還原性，可以和共軛系統發生加成反應，改變中間產物的結構，也可以通過與Amadori產物反應影響中間產物的生成，從而改變294 nm處的吸光值[3]。添加檸檬酸后，A294顯著低于空白組，但各添加量之間沒有顯著性差異。低pH可以抑制美拉德反應的初始階段，同時檸檬酸根可以螯合金屬離子，減少其對Amadori產物自氧化的催化作用，從而減少中間產物的生成[3]。隨著D-異抗壞血酸鈉的添加量增加，A294呈增加后降低再增加的波動趨勢。D-異抗壞血酸鈉可以對甲基乙二醛等活性羰基化合物進行修飾，同時自身氧化可以產生還原酮等美拉德中間產物[20, 25]。A294的波動趨勢可能是這2種反應綜合作用的結果。

在波長420 nm處的吸光值表示褐變度，與美拉德反應最終階段生成的褐變產物(類黑精)有關[15]。由表1可知，殺菌后A420增加了60.0%，調味魚發生了較明顯的褐變。隨著L-半胱氨酸添加量的增加，A420先穩定后增加至顯著高于空白組(P<0.05)。低濃度時半胱氨酸與其他氨基酸的Amadori產物反應減少褐變物質的生成，高濃度時可能生成了自身的美拉德反應產物，導致呈色物質積累。不同氨基酸的美拉德反應產物具有不同的顏色特征，且半胱氨酸的加入改變了調味魚中糖和氨基酸的比例，也會對褐變度造成影響[26]。隨著檸檬酸添加量的增加，A420降低趨于平緩后緩慢增加，但均顯著低于空白組。酸抑制美拉德反應初始階段，且使Amadori產物更容易發生1，2-烯醇化。有研究表明，2，3-烯醇化是美拉德反應色素物質生成的主要途徑[16]。這與GENG等[12]的研究結果一致，其研究表明pH 6.0 的魷魚褐變度顯著高于pH 5.5。但也有研究表明，檸檬酸具有一定緩沖能力，可以加速褐變[24]。隨著D-異抗壞血酸鈉添加量的增加，A420先降低至顯著低于空白組，后增加至顯著高于空白組。添加量較低時，主要通過對活性羰基化合物等的修飾減少呈色物質的積累，抑制體系的褐變反應。添加量較高時，自身氧化產物進入美拉德反應，導致褐變度增加[25]。

a-熒光強度;b- A420(實線)和A294(虛線)圖4 不同添加量的護色劑對殺菌后調味魚美拉德反應程度的影響Fig.4 Effects of color protectants on the reaction degree of seasoned fish Maillard after sterilization

3 結論

殺菌后，調味魚的L*、a*、b*、ΔE值均降低，調味魚顏色變暗。適量添加L-半胱氨酸、檸檬酸、D-異抗壞血酸鈉可以提高殺菌后調味魚色差值，最適添加量分別為0.3%、0.4%、0.1%。其中，L-半胱氨酸作為護色劑的效果最好。殺菌過程發生了美拉德反應，消耗了葡萄糖，生成了5-HMF，增加了熒光強度、A294和A420。半胱氨酸可以和還原糖或中間產物反應，降低了5-HMF含量、熒光強度和A294，但高濃度時導致A420增加。檸檬酸減少葡萄糖的利用，降低了5-HMF含量、熒光強度、A294和A420。D-異抗壞血酸鈉低濃度時抑制，高濃度時促進美拉德反應，5-HMF含量、熒光強度、A294和A420隨添加量的增加先降后增。添加護色劑，影響了美拉德反應物的利用和產物的生成，從而改變了調味魚的顏色，但不排除色素降解等其他因素對顏色變化影響的可能性，還有待進一步研究。