響應面法優化苯酚-硫酸法測定泡桐花多糖含量

呂亭亭，楊志華，韓永紅，孟 鑫，陶 娟，劉 旭*

(1.江蘇護理職業學院藥學與中藥學院，江蘇 淮安 223005；2.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300381)

泡桐，屬于玄參科泡桐屬雙子葉植物，其資源豐富，分布廣泛，種類繁多，主要是白花泡桐、毛泡桐、光葉泡桐等，在黃河流域被用作傳統醫藥數百年[1]。研究發現，泡桐植物的根、花、葉、皮、果均可入藥，具有抗氧化[2]、抗菌[3-4]、抗病毒[5]等藥理活性。泡桐花(Paulowniaeflos)即為泡桐的花，主要含有黃酮類、多糖、生物堿、有機酸、氨基酸等活性成分，具有清熱解毒、疏風散熱、燥濕止痢、清肝明目等功能[6-7]。

近年來研究發現，從泡桐花中提取的多糖，在增強機體免疫功能、抗腫瘤、抗炎、調血脂、降血糖和抗衰老等方面具有顯著的生物活性[8-9]，受到研究者的廣泛關注。現階段，測定多糖含量的方法主要有色譜法和比色法。色譜法操作繁瑣、過程復雜，很少單獨用于多糖含量的測定；而苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等比色法由于操作簡單、實用性強，在多糖研究中應用廣泛[10-13]。研究發現，苯酚-硫酸法在穩定性和準確性上均優于蒽酮-硫酸法[14-16]。鑒于此，作者選擇苯酚-硫酸法測定泡桐花多糖含量，首先對苯酚-硫酸法測定泡桐花多糖含量的方法學進行驗證，然后在單因素實驗的基礎上，選擇苯酚用量、硫酸用量和顯色時間為變量進行3因素3水平的Box-Behnken實驗設計，通過響應面法進一步優化顯色條件，在最佳條件下測定泡桐花多糖含量，以期為泡桐花多糖的開發應用提供檢測依據[17-18]。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

泡桐花，產自河南蘭考，將干燥后的泡桐花用多功能粉碎機粉碎成300目，備用。

乙醇、苯酚、硫酸均為分析純，無錫亞盛化工有限公司。

BF-10型多功能粉碎機，河北本辰科技有限公司；UV1800型紫外可見分光光度計，日本島津公司；HH-2型數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；BSA型電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；PS-60型超聲波清洗器，蘇州創惠電子有限公司。

1.2 泡桐花的預處理

稱取泡桐花粉末30.0 g，石油醚脫脂[19]，過濾，濾渣置于60 ℃烘箱烘干；加入600 mL 80%乙醇加熱回流處理，以除去黃酮類物質，過濾，濾渣置于60 ℃烘箱烘干，稱定，儲存，備用。

1.3 溶液的配制

1.3.1 苯酚溶液的配制

稱取苯酚2.5 g，置于50 mL棕色容量瓶中，加蒸餾水在超聲輔助作用下溶解，定容，放入冰箱，避光保存，備用。

1.3.2 標準溶液的配制

精密稱取適量的無水葡萄糖標準品，加蒸餾水溶解，配制成0.1 mg·mL-1的葡萄糖標準溶液[20-21]。

1.3.3 供試溶液的配制

稱取預處理后的泡桐花粉末2.0 g，加入40 mL蒸餾水，稱定；70 ℃回流1 h，冷卻，再次稱定，用蒸餾水補足失重；離心，取20 mL上清液，邊攪拌邊滴加無水乙醇80 mL，靜置20 h；離心，棄去上清液，沉淀用蒸餾水溶解并轉移至50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，作為供試儲備液。精密量取5 mL供試儲備液，置于50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，作為供試溶液。

1.4 苯酚-硫酸法單因素實驗

量取2 mL供試溶液，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。分別考察苯酚用量(0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL)、硫酸用量(1.0 mL、3.0 mL、5.0 mL、7.0 mL、9.0 mL)、水浴溫度(25 ℃、40 ℃、55 ℃、70 ℃、85 ℃、100 ℃)及顯色時間(10 min、15 min、20 min、25 min、30 min)對吸光度的影響。

1.5 苯酚-硫酸法響應面實驗

在單因素實驗的基礎上，選取苯酚用量(A)、硫酸用量(B)、顯色時間(C)3個因素為自變量，運用Design-Expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken設計實驗，并應用響應面法對苯酚-硫酸法測定泡桐花多糖含量的條件進行優化。Box-Behnken設計實驗的因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken設計實驗的因素與水平

2 結果與討論

2.1 檢測波長的確定

分別量取供試溶液、0.04 mg·mL-1葡萄糖標準溶液和蒸餾水各2.0 mL，置于具塞試管中，按照苯酚-硫酸法顯色條件顯色，迅速冰浴冷卻，用紫外可見分光光度計在400～600 nm波長范圍內掃描，測定最大吸收波長，結果如圖1所示。

圖1 吸光度-波長曲線Fig.1 Absorbance-wavelength curves

從圖1可知，泡桐花多糖和葡萄糖標準品最大吸收波長均為490 nm。因此，選擇490 nm作為檢測波長。

2.2 方法學考察

2.2.1 線性方程與檢測范圍

精密量取1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL的0.1 mg·mL-1葡萄糖標準溶液，分別加蒸餾水稀釋至10 mL，搖勻。精密量取2.0 mL供試溶液置于具塞試管中，按照苯酚-硫酸法顯色條件顯色，取出，迅速冰浴冷卻；另取2.0 mL蒸餾水同法操作，空白調零，測定溶液在490 nm處吸光度，以葡萄糖濃度(x，mg·mL-1)為橫坐標、吸光度(y)為縱坐標繪制標準曲線(圖2)，擬合得到線性方程y=11.202x+0.0145，R=0.9993。表明，葡萄糖濃度在0.01～0.08 mg·mL-1范圍內與吸光度線性關系良好。

圖2 葡萄糖標準曲線Fig.2 Standard curve of glucose

2.2.2 重復性

精密稱取6份預處理后的泡桐花粉末2.0 g，按1.3.3方法制備供試溶液，苯酚-硫酸法顯色，用紫外可見分光光度計測定490 nm處吸光度，每份樣品平行測定3次，計算泡桐花多糖含量及RSD，結果見表2。

從表2可知，泡桐花多糖的平均含量為2.48%，RSD為1.2%，小于1.5%，符合藥典規定，表明該方法重復性良好。

表2 重復性實驗結果

2.2.3 日間精密度

精密稱取預處理后的泡桐花粉末2.0 g，按1.3.3方法每天制備一份供試溶液，共6份，苯酚-硫酸法顯色，用紫外可見分光光度計測定490 nm處吸光度，每份樣品平行測定3次，計算泡桐花多糖含量及RSD，結果見表3。

表3 日間精密度實驗結果

從表3可知，泡桐花多糖的平均含量為2.58%，RSD為1.3%，小于1.5%，符合藥典規定，表明該方法日間精密度良好。

2.2.4 加標回收率

精密稱取預處理后的泡桐花粉末2.0 g，按1.3.3方法制備供試溶液，再分別加入相當于2.0 g樣品中所含葡萄糖50%、100%和150%的標準品，每個濃度平行制備3份樣品，苯酚-硫酸法顯色，用紫外可見分光光度計測定490 nm處吸光度，每份樣品平行測定3次，計算泡桐花多糖的加標回收率及RSD，結果見表4。

從表4可知，泡桐花多糖的加標回收率在98.94%～101.93%之間，低、中、高濃度的RSD分別為1.0%、1.4%、1.2%，符合藥典規定，表明該方法準確度良好。

2.2.5 穩定性

精密稱取預處理后的泡桐花粉末2.0 g，按1.3.3方法制備供試溶液，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h取樣測定490 nm處吸光度，每份樣品平行測定3次，計算得到泡桐花多糖含量分別為2.62%、

表4 加標回收率實驗結果

2.61%、2.66%、2.67%、2.64%、2.63%、2.65%，平均含量為2.64%，RSD為0.82%，小于1.5%，表明該供試溶液在0～12 h內穩定。

2.3 苯酚-硫酸法單因素實驗結果

2.3.1 苯酚用量對吸光度的影響(圖3)

圖3 苯酚用量對吸光度的影響Fig.3 Effect of phenol amount on absorbance

從圖3可知，苯酚用量在0.2～1.0 mL范圍內時，吸光度先增大后減小，在苯酚用量為0.4 mL時，吸光度最大。故最佳苯酚用量為0.4 mL左右。

2.3.2 硫酸用量對吸光度的影響(圖4)

圖4 硫酸用量對吸光度的影響Fig.4 Effect of sulfuric acid amount on absorbance

從圖4可知，硫酸用量在1.0～9.0 mL范圍內時，吸光度先增大后減小，當硫酸用量為5.0 mL時，吸光度最大。這是因為，硫酸用量過少時，多糖水解成單糖的程度不充分，導致吸光度偏小；而硫酸用量過大時，生成的糖醛衍生物不穩定、易分解，也會導致吸光度偏小。故最佳硫酸用量為5.0 mL左右。

2.3.3 水浴溫度對吸光度的影響(圖5)

圖5 水浴溫度對吸光度的影響Fig.5 Effect of water bath temperature on absorbance

從圖5可知，水浴溫度在25～100 ℃范圍內時，吸光度先增大后減小，當水浴溫度為40 ℃時，吸光度最大。故最佳水浴溫度為40 ℃。

2.3.4 顯色時間對吸光度的影響(圖6)

圖6 顯色時間對吸光度的影響Fig.6 Effect of coloration time on absorbance

從圖6可知，顯色時間在10～30 min范圍內時，吸光度先增大后減小，當顯色時間為25 min時，吸光度最大。故最佳顯色時間在25 min左右。

2.4 響應面實驗結果

2.4.1 Box-Behnken設計結果

采用Box-Behnken設計實驗，分別以苯酚用量(A)0.4 mL、硫酸用量(B)5.0 mL和顯色時間(C)25 min為中心點，進行3因素3水平優化實驗，結果見表5。

表5 Box-Behnken設計實驗結果

2.4.2 響應面實驗模型及方差分析

運用Design-Expert 8.0.6軟件對表5數據進行擬合，得回歸方程模型：Y=2.83+0.14A+0.12B+0.036C+0.065AB+0.19AC-0.063BC-0.41A2-0.54B2-0.39C2。模型方差分析見表6。

表6 響應面實驗模型方差分析

2.4.3 各因素間的交互作用

各因素間的交互作用對泡桐花多糖含量影響的響應面圖和等高線圖如圖7所示。

響應面圖中圖形陡峭程度越大代表影響越大，反之越小[22]。從圖7可知，苯酚用量對泡桐花多糖含量的影響最大，硫酸用量次之，顯色時間的影響最小，這與表6的分析結果一致。等高線圖呈橢圓形，說明各因素的交互作用顯著，呈圓形則為交互作用不顯著[23]。從圖7還可知，苯酚用量和顯色時間之間的交互作用較顯著。

2.4.4 最佳條件的確定

通過Design-Expert 8.0.6軟件分析，得到苯酚-硫酸法測定泡桐花多糖含量的最佳條件為：苯酚用量0.42 mL、硫酸用量5.12 mL、顯色時間25.43 min，在此條件下，泡桐花多糖含量的預測值為2.85%。考慮實際操作等因素，將最佳條件調整為：苯酚用量0.4 mL、硫酸用量5.0 mL、顯色時間25 min。

2.5 多糖含量測定

分別稱取6份預處理后的泡桐花粉末2.0 g，按1.3.3方法制備供試溶液，在苯酚用量為0.4 mL、硫酸用量為5.0 mL、顯色時間為25 min時進行顯色反應，每份樣品平行測定3次。計算得到泡桐花多糖的平均含量為2.65%，RSD為2.95%，表明優化后的苯酚-硫酸法測定條件穩定可行。

3 結論

對苯酚-硫酸法測定泡桐花多糖含量的方法學進行驗證，在單因素實驗的基礎上，選擇苯酚用量、硫酸用量和顯色時間為變量進行3因素3水平的Box-Behnken設計實驗，通過響應面法進一步優化顯色條件，在最佳條件下測定泡桐花多糖含量。確定苯酚-硫酸法測定泡桐花多糖含量的最佳條件為：苯酚用量0.4 mL、硫酸用量5.0 mL、顯色時間25 min，在此條件下，泡桐花多糖平均含量為2.65%，RSD為2.95%，與預測值接近，說明優化后的苯酚-硫酸法穩定可靠，更加適用于泡桐花多糖含量的測定。

(a)苯酚用量和硫酸用量的交互作用 (b)苯酚用量和顯色時間的交互作用 (c)硫酸用量和顯色時間的交互作用