高遷移率族蛋白B1對呼吸機相關性肺炎患者短期內撤機的預測價值

孫雪東 嚴一核 褚韋韋 張亦婷 劉芳 應利君

呼吸機相關性肺炎（ventilator associated pneumonia，VAP）是ICU機械通氣患者最常見的感染性疾病之一。重癥患者易發生VAP，多與其基礎狀態、診療操作、藥物治療等有關[1]。臨床上，往往在患者發生VAP后，醫生根據經驗和藥敏試驗結果給予抗生素治療，如果早期使用廣譜抗生素會增加細菌的耐藥性。但是VAP病情進展快、過程復雜，因此亟需尋找一種能有效預測VAP病情的指標，指導盡早撤機拔管，進而改善患者的預后。研究表明，高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）與巨噬細胞的吞噬活性、宿主的免疫反應等密切相關，對肺部感染的診斷與預后評估具有一定的價值[2]；但其對VAP患者能否早期撤機拔管的預測價值尚未明確[3]，故本研究作一探討，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2016年1月至2018年12月在紹興市人民醫院行機械通氣且發生VAP的62例患者為研究對象，所有患者在確診VAP后采集支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）進行培養。其中男 34例，女 28例；年齡（62.87±15.34）歲；入組時臨床肺部感染評分（clinical pulmonary infection score，CPIS）為（4.06±1.67）分，急性生理和慢性健康評分Ⅱ（APACHE Ⅱ）為（17.55±5.32）分；外科術后36例（包括腹部外科術后19例，骨科術后12例，泌尿系統術后5例），腦血管及神經系統病變20例，心肺復蘇后3例，其他3例。VAP臨床診斷標準依據2013年中華醫學會重癥醫學分會制定的《VAP預防、診斷和治療指南》，即有創機械通氣48 h以上或撤機、拔管后48 h內胸部X線片可見新發或進展性浸潤陰影，且同時滿足以下任意2項可考慮診斷為 VAP：（1）體溫＞38 ℃或＜36 ℃；（2）外周血WBC＞10×109/L 或＜4×109/L；（3）氣管支氣管內出現膿性分泌物；同時除外肺水腫、急性呼吸窘迫綜合征、肺結核、肺栓塞等疾病，結合微生物學診斷。排除標準：（1）患有肺纖維化、免疫性疾病、肺部腫瘤的患者；（2）長期使用激素者；（3）妊娠婦女；（4）年齡＜18 歲；（5）入 ICU 前已明確存在肺部感染者。本研究經醫院倫理委員會審查通過，所有患者簽署知情同意書。根據臨床上發生VAP的時間分成VAP早發（機械通氣≤4 d）組32例和晚發（機械通氣＞4 d）組30例。

1.2 方法

1.2.1 收集資料 收集患者臨床資料，包括性別、年齡、機械通氣時間、ICU住院時間以及確診VAP當天APACHE Ⅱ、CPIS、氧合指數（PaO2/FiO2）、7 d 機械通氣撤機拔管率等。

1.2.2 BALF中細胞因子水平檢測 采用ELISA法。參照中華醫學會呼吸分會制定2002年制定的《BALF細胞學檢測技術規范（草案）》。用雙層紗布過濾BALF，去除黏液，將濾液放入50 ml的聚丙烯試管中，1 500 r離心10 min，取上清液置于-20℃冰箱內備用。取BALF上清液，使用ELISA試劑盒（Thermo Scientific公司）檢測TNF-α、IL-8、HMGB1等細胞因子水平，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.3 肺泡巨噬細胞提取及吞噬活性檢測 取BALF離心后沉淀物，用10 ml預冷的Hanks液再行懸浮；然后用10 ml預冷的Hanks液清洗2次。將細胞懸液接種到培養瓶中，在37℃、5%CO2環境下孵育90～120 min。輕輕震蕩搖勻，去除介質與非黏附細胞；加入1 ml預熱的RPMI 1640培養液，輕輕搖勻，清洗3～4次。用1 ml含有5 mM EDTA的PBS孵育5 min，提取黏附的巨噬細胞，移液，加入1 ml肺泡巨噬細胞培養基冷浸。用0.1%的臺盼藍計數評價細胞活力，要求在95%以上。調整細胞濃度為2×106個/ml，分別置于培養板中及若干個有載薄片的培養皿中。成功分離培養巨噬細胞后進行熒光微球吞噬實驗，在上述培養皿中按1∶100比例加入異硫氰酸熒光素（FITC）標記乳膠微球，置于細胞培養箱中37℃孵育60 min，最后用4℃ PBS清洗未被吞噬的微球。使用表面熒光顯微鏡計數每個巨噬細胞的FITC標記微球個數，每張標本計數50個細胞。

1.2.3 肺泡巨噬細胞內HMGB1蛋白表達檢測 采用Western blot法。取分離培養的肺泡巨噬細胞，調整細胞濃度為5×106個/ml，分別置于培養皿中，在冰上操作（加RIPA液裂解，吹打、震搖、離心），取上清液進行SDSPAGE 電泳，轉膜，用一抗 HMGB1（1∶1 000，美國 Santa Cruz公司）、β-actin（1∶2 000，美國 Santa Cruz公司）孵育過夜；最后用二抗孵育2h，ECL試劑顯色，利用JYClear ECL型化學發光凝膠成像分析系統進行成像。目標蛋白吸光值與內參的比值，即為目標蛋白相對表達量。

1.3 統計學處理 采用SPSS 18.0統計軟件。計量資料用表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。繪制ROC曲線，分析相關指標對7 d機械通氣撤機拔管的預測效能。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者臨床資料比較 VAP早發組與晚發組患者性別、年齡以及確診VAP當天APACHEⅡ、CPIS、PaO2/FiO2比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）；晚發組機械通氣時間、ICU住院時間明顯短于早發組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

2.2 兩組患者BALF中細胞因子水平比較 早發組確診 VAP時 BALF中 TNF-α、IL-8、HMGB1水平明顯高于晚發組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2。

2.3 兩組患者肺泡巨噬細胞吞噬活性及HMGB1蛋白相對表達量比較 VAP晚發組肺泡巨噬細胞吞噬活性（6.6±2.0）強于早發組（4.8±2.7），巨噬細胞中 HMGB1蛋白相對表達量（1.2±0.6）低于早發組（1.9±0.8），差異均有統計學意義（t=2.82、3.98，均 P＜0.05），見圖 1。

2.4 BALF中HMGB1水平、肺泡巨噬細胞吞噬活性及HMGB1蛋白相對表達量對7 d機械通氣撤機拔管的預測效能 62例患者7 d機械通氣撤機拔管44例，占71.0%。BALF中HMGB1水平預測7 d機械通氣撤機拔管的 AUC 為 0.75（95%CI：0.65～0.79），截斷值為 50.0 μg/L，靈敏度為0.78，特異度為0.70；肺泡巨噬細胞吞噬活性預測7 d機械通氣撤機拔管的AUC為0.79（95%CI：0.68～0.90），截斷值為 6.5，靈敏度為 0.73，特異度為 0.70；巨噬細胞HMGB1蛋白相對表達量預測7 d機械通氣撤機拔管的 AUC 為 0.73（95%CI：0.61～0.86），截斷值為1.4，靈敏度為 0.72，特異度為 0.73，見圖2。

3 討論

人工氣道解決了患者急性呼吸衰竭的問題，但是會破壞呼吸系統的防御機制。由于危重癥患者基礎疾病嚴重、全身免疫功能低下，VAP然是機械通氣患者最常見的感染性疾病之一。有文獻報道重癥患者VAP發病率高達6%～52%，病死率為14%～50%[3]。因此，亟需尋找一種預測患者VAP病情的指標，指導早期撤機拔管，進而改善患者預后[4-5]。目前已有文獻報道多種臨床指標可能有助于VAP預后的判斷，但是存在一些問題，如APATCH Ⅱ、CPIS等在VAP發生早期的特異度或靈敏度不高，降鈣素原、CRP等受全身因素的干擾[6-7]。近年來研究表明，HMGB1可能參與了膿毒癥的全部病理過程，與巨噬細胞的吞噬活性、宿主的免疫反應密切相關，對肺部的感染診斷和預后評估或許有很大價值[8-9]。

HMGB1是一種高度保守的核蛋白，廣泛分布在哺乳動物的細胞內，一旦分泌到細胞外即可誘導炎癥反應[10]。研究表明，減少HMGB1從巨噬細胞內向細胞外釋放，可以減少組織的炎癥反應[11]。有動物實驗證明，急性肺損傷促使大鼠肺泡巨噬細胞HMGB1高表達并向外周組織釋放，予以干預后可以明顯抑制肺組織HMGB1的表達，并激活細胞凋亡通路，對肺組織有一定的保護作用[12]。本研究結果顯示，VAP確診當天兩組患者APATCHⅡ、CPIS、PaO2/FiO2差異無統計學意義，但機械通氣時間、ICU住院時間差異有統計學意義。進一步檢測發現，VAP早發組 BALF中 TNF-α、IL-8、HMGB1水平以及肺泡巨噬細胞HMGB1蛋白相對表達量高于VAP晚發組，巨噬細胞吞噬活性低于VAP晚發組。但是這些指標不能反映組內患者的預后情況，而筆者更關注VAP發生后患者7 d內撤機拔管率，因為呼吸機使用超過1周會增加二次感染發生率，甚至需要采取氣管切開等措施[13]。本研究結果發現，BALF中HMGB1水平、肺泡巨噬細胞HMGB1蛋白相對表達量、巨噬細胞吞噬活性對患者7 d撤機拔管均有較高的預測效能。

表1 兩組患者臨床資料比較

表2 兩組患者BALF中細胞因子水平比較

圖1 兩組患者肺泡巨噬細胞吞噬活性及高遷移率族蛋白B1（HMGB1）蛋白相對表達量比較[a：兩組肺泡巨噬細胞HMGB1蛋白表達的電泳圖及相對表達量比較；b：兩組患者肺泡巨噬細胞熒光微球吞噬實驗結果及吞噬活性比較；與VAP早發組比較，*P＜0.05]

圖2 支氣管肺泡灌洗液（BALF）中高遷移率族蛋白B1（HMGB1）水平、肺泡巨噬細胞吞噬活性及HMGB1蛋白相對表達量預測7d機械通氣撤機拔管的ROC曲線

綜上所述，HMGB1和肺泡巨噬細胞吞噬活性可作為預測VAP患者短期內撤機的可靠指標，有助于指導VAP的治療；但對HMGB1的干預是否能進一步改善VAP患者的預后，有待進一步研究證實。