miR-4472的靶基因預(yù)測及生物信息學(xué)分析

劉玨 陳星光 朱雯 侯秋英 張旭 沈方方 滕懿群

新生兒缺氧缺血性腦病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）是一種嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其病情重、病死率高、預(yù)后差，部分患兒會留下腦癱、智力發(fā)育低下、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[1]。加上目前尚無HIE診斷的金標準，臨床治療亦缺乏特異性，總體療效欠佳。微小RNA（microRNA，miRNA)是一類內(nèi)源性非蛋白質(zhì)編碼的小分子RNA，可參與諸多生命過程并發(fā)揮重要的生物學(xué)作用，是當前生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點[2]。筆者所在團隊前期研究已通過芯片檢測篩選出HIE相關(guān)miRNA，同時應(yīng)用RT-PCR法驗證差異表達明顯的miRNA，結(jié)果顯示HIE患兒血漿中miR-4472表達水平明顯升高，miR-4472可能是預(yù)測HIE預(yù)后的生物標志物[3]，但其相關(guān)調(diào)控機制尚未明確。為此，本研究擬應(yīng)用生物信息學(xué)分析方法預(yù)測miR-4472的靶基因及信號通路，為miR-4472在HIE發(fā)生、發(fā)展中的調(diào)控機制研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 miR-4472的物種保守性分析 利用miRBase數(shù)據(jù)庫（http://www.mirbase.org）檢索miRNA序列，分析其物種保守性。

1.2 miR-4472的靶基因預(yù)測 通過Targetscan（http://www.targetscan.org）、miRDB（http://mirdb.org）、miRTar－Base（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）靶基因數(shù)據(jù)庫在線預(yù)測miR-4472的靶基因，對3者結(jié)果進行venny圖構(gòu)建，得到交集靶基因。

1.3 miR-4472預(yù)測靶基因的生物功能及信號通路富集分析 應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫，將miR-4472的預(yù)測靶基因集合進行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）生物通路富集分析。GO分析包括細胞組分、分子功能及生物過程等3個部分，P＜0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Fisher確切概率法統(tǒng)計基因集合相對背景生物通路的P值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-4472的物種保守性分析 利用miRBase數(shù)據(jù)庫在線檢索人類、小鼠、大鼠、獼猴等各物種的miRNA序列進行對比，發(fā)現(xiàn)miR-4472序列“GGUGGGGGG UGUUGUUU”在各物種間高度保守。

2.2 miR-4472的靶基因預(yù)測 Targetscan、miRDB、miRTarBase等3個靶基因數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示，miR-4472靶基因分別有 4 943、418、179個；3者交集靶基因僅35個，不能用于數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。因此，筆者選取Targetscan、miRDB等2個數(shù)據(jù)庫的結(jié)果交集，顯示共有378個預(yù)測靶基因。

2.3 miR-4472預(yù)測靶基因的生物功能及信號通路分析 將預(yù)測的378個交集靶基因通過DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO功能富集分析和KEGG生物通路富集分析。GO分析結(jié)果顯示，miR-4472靶靶基因富集在基底外膜、核染色質(zhì)、突觸囊泡膜、突觸后致密物、異染色質(zhì)等細胞組件，參與轉(zhuǎn)錄因子活性、DNA結(jié)合、蛋白連接酶結(jié)合等分子功能，涉及轉(zhuǎn)錄的正負調(diào)節(jié)、細胞凋亡、蛋白質(zhì)磷酸化等生物過程，見表1～3。KEGG信號通路分析結(jié)果顯示，miR-4472的靶基因信號傳導(dǎo)顯著富集于PI3K-Akt信號通路、胰高血糖素相關(guān)信號通路、心肌細胞中的腎上腺素能信號傳導(dǎo)通路、醛固酮的合成和分泌相關(guān)信號通路，見表4。

3 討論

自1993年科學(xué)家發(fā)現(xiàn)第一個miRNA（lin-4）以來，對關(guān)于miRNA功能的細胞生物學(xué)、遺傳學(xué)及臨床各學(xué)科研究成為近年來的熱點之一[4]。越來越多證據(jù)表明，miRNA可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達，廣泛參與細胞增殖、分化以及凋亡等多種過程，同時研究證實其在缺血性腦卒中、帕金森病、腫瘤、阿爾茨海默病等多種神經(jīng)系統(tǒng)性疾病中發(fā)揮重要作用[5-7]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，HIE患兒血漿中miR-4472表達水平明顯升高，miR-4472可能是預(yù)測HIE預(yù)后的生物標志物[3]，但其相關(guān)調(diào)控機制尚不明確。因此，本研究首先通過miRBase數(shù)據(jù)庫對miR-4472物種的序列保守性進行在線分析，檢索發(fā)現(xiàn)其在多個物種中呈高度保守，說明在進化過程中這一段特殊序列在不同物種中均被完整保存下來，提示在功能研究方面有一定的價值，可能具有重要的生物學(xué)功能。再利用Targetscan、miRDB等靶基因數(shù)據(jù)庫進行預(yù)測，分析miR-4472可能的生物學(xué)功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其生物過程主要在軸突發(fā)生的負調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄的正負調(diào)節(jié)、DNA模板、細胞凋亡、蛋白質(zhì)磷酸化等方面，提示miR-4472可能在神經(jīng)細胞的周期調(diào)控、細胞凋亡等方面具有重要作用。

表1 miR-4472預(yù)測靶基因的細胞組分

表2 miR-4472預(yù)測靶基因的分子功能

表3 miR-4472預(yù)測靶基因的生物過程

表4 miR-4472預(yù)測靶基因的KEGG信號通路分析

在KEGG信號通路分析結(jié)果中，值得注意的是miRNA-4472的靶基因顯著富集于P13K/Akt信號通路。P13K/Akt信號通路作為經(jīng)典的抗凋亡通路，又被稱為再灌注損傷救援激酶途徑。當該信號通路被激活時，可通過調(diào)節(jié)下游凋亡相關(guān)靶蛋白和靶基因抑制神經(jīng)細胞凋亡，進而發(fā)揮腦保護作用，但確切作用機制并未完全清楚[8-9]。有研究構(gòu)建了新生大鼠缺氧缺血性腦損傷模型，發(fā)現(xiàn)當神經(jīng)元缺氧缺血時可激活P13K/Akt信號通路，誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）蛋白表達增加，并認為P13K/Akt信號通路可能是HIE治療的新靶點[10]。miRNA不論是通過經(jīng)典還是非經(jīng)典的作用途徑，最終都是在轉(zhuǎn)錄、翻譯過程中下調(diào)靶蛋白的表達量，往往與靶基因的作用相反[11]。以上結(jié)果提示miRNA-4472可能通過抑制P13K/Akt信號通路相關(guān)基因如CREB、PRLR及G6PC2等的表達，加重腦損傷并增加遠期神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥發(fā)生的風(fēng)險。HIE患兒除典型腦病癥狀外，缺氧持續(xù)存在，時常伴有全身多個臟器的損傷、電解質(zhì)紊亂、血糖異常等[12]。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，miR-4472的靶基因亦富集于胰高血糖素相關(guān)信號通路、心肌細胞中的腎上腺素能信號傳導(dǎo)通路及醛固酮的合成和分泌相關(guān)信號通路，說明miR-4472表達不僅與HIE患兒神經(jīng)系統(tǒng)損害程度有關(guān)，也可能在心肌細胞功能、電解質(zhì)及血糖調(diào)控方面產(chǎn)生影響。

綜上所述，本研究應(yīng)用生物信息學(xué)分析方法預(yù)測了miR-4472的靶基因及信號通路，發(fā)現(xiàn)靶基因富集的信號通路均與HIE密切相關(guān)，尤其是P13K/Akt信號通路。后期將以此理論及實驗為基礎(chǔ)，進一步探究miR-4472在HIE發(fā)生、發(fā)展過程中的調(diào)控機制。