燕麥 AsSnRK2.7編碼蛋白的分子特征及基因表達特異性研究

向殿軍，滿麗莉，王曉東，張巍巍，劉 鵬，李志剛

(1.內蒙古民族大學農學院，內蒙古通遼 028042；2.內蒙古民族大學生命科學學院,內蒙古通遼 028042)

植物蔗糖非發酵-1相關蛋白激酶(sucrose non-fermenting-1-related protein kinase,SNRK)家族屬于CDPK-SNRK超家族，與酵母的蔗糖非發酵蛋白激酶1(SNF1)和哺乳動物的AMP激活的蛋白激酶(AMPK)同源[1]。在酵母和哺乳動物中，SNF1和AMPKs在碳水化合物代謝中扮演重要角色；而在植物中，SnRKs在連接脅迫信號和新陳代謝通路方面發揮關鍵作用[2-4]。根據氨基酸序列和結構域的相似性，植物SnRKs又可分為SnRK1、SnRK2和SnRK3三個亞家族[4]。

SnRK2蛋白激酶是主要的信號轉導因子，在調節真核生物適應環境方面起核心作用。水稻中的SAPK4和小麥中的TaSRK2C1均屬于SnRK2蛋白激酶家族基因。在鹽脅迫下，SAPK4基因的過表達減少了水稻中Na+和Cl-的積累，并使水稻光合作用和生長狀況得到明顯改善[5]。與野生型煙草相比，轉TaSRK2C1基因煙草中具有較高水平的游離脯氨酸和可溶性碳水化合物，說明TaSRK2C1的異源表達提高了煙草對高鹽、脫水和低溫脅迫的耐受性[6]。TaSnRK2.8基因的異源過表達可改善擬南芥的主根長、相對含水量、細胞膜穩定性、滲透勢和葉綠素含量等生理特性，從而使擬南芥對干旱、鹽和冷脅迫的耐受性得到增強[7]。SnRK2蛋白激酶可通過控制鎘離子引發的活性氧積累，調節植物對重金屬脅迫的耐受性[8]。在干旱脅迫下，脫落酸(ABA)使植物氣孔關閉，從而減少水分損失，而擬南芥snrk2e(snrk2.6/ost1)突變體則破壞了ABA誘導的氣孔關閉機制，抑制氣孔開放，表明SnRK2E參與ABA信號傳導[9]。

SnRK2蛋白激酶主要通過ABA依賴或非ABA依賴途徑在應答逆境脅迫的防御機制中起著至關重要的作用[10]。其中，ABA依賴型的SnRK2蛋白激酶(如擬南芥SnRK2D、SnRK2I和SnRK2E)在ABA信號傳遞中起關鍵作用[11]，其調控通路模型主要由可溶性ABA受體(PYR/PYL/RCAR)、蛋白磷酸酶2C(PP2C)和SnRK2絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族組成[12-14]。在沒有ABA的情況下，PP2Cs發生去磷酸化作用，鈍化了SnRK2s活性，進而抑制SnRK2s磷酸化調控的反應通路。

目前，一些植物體內的蛋白質已被鑒定為SnRK2蛋白激酶的底物[15-17]。此外，在一些異源表達SnRK2基因的植物中，也發現一些SnRK2蛋白激酶作用的靶標基因[6-7]。如小麥TaSRK2C1蛋白激酶能顯著上調煙草DREB2、DREB1A和DREB2三個中樞調節因子的表達水平[6]，而小麥TaSnRK2.8蛋白激酶則能調控擬南芥中CBF3、CBF2、CBF1、RD29B、RD20A、ABI5、ABI4、ABI3、ABA2和ABA1基因的mRNA水平[7]。

目前，SnRK2基因家族在小麥[6-7]、波蘭小麥[18]和二穗短柄草[19]等一些燕麥(AvenasativaL.)近源種中已得到研究，但有關SnRK2基因在燕麥中的功能尚未見報道。因此，本研究以皮燕麥品種美達為材料，借助前人獲得的干旱脅迫下燕麥RNA序列信息，克隆SnRK2蛋白激酶家族基因AsSnRK2.7，利用生物信息學手段和煙草表皮細胞瞬時表達試驗分別對AsSnRK2.7蛋白的分子特征和亞細胞定位進行分析，同時借助qRT-PCR技術對AsSnRK2.7基因的非生物脅迫反應和組織表達特異性進行研究，以期為揭示AsSnRK2.7基因應答逆境脅迫的分子機制及其功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為美國皮燕麥品種美達(Monida)，購于北京正道生態科技有限公司，由內蒙古民族大學作物遺傳育種實驗室擴繁并保存。

1.2 材料處理

將發育良好、飽滿的燕麥種子用0.1% HgCl2溶液表面消毒30 min，用無菌水洗滌數次后，將種子放在鋪有兩層濾紙的培養皿上，置于發芽箱(23±1 °C，光照12 h，黑暗12 h)中，每日添加10 mL無菌水，至種子發芽。將發芽整齊一致的種子分成兩份，一份轉移至盛有1/2 Hoagland培養液的水培盤(32.5 cm×26 cm×5.5 cm)中，一份播種到土壤中進行培養。培養條件為相對濕度70%，光照強度400 μmol·m-2·s-1，20 ℃暗培養9 h，25 ℃光照15 h。待水培燕麥幼苗長至三葉一心期時，分別進行ABA、干旱、高鹽和低溫脅迫處理。ABA脅迫處理：用ABA溶液(100 μmol·L-1)噴灑燕麥；干旱脅迫處理：水培液中添加PEG6000(25 mmol·L-1)；高鹽脅迫處理：水培液中添加NaCl(300 mmol·L-1)；低溫脅迫處理：將水培燕麥幼苗置于低溫(4 ℃)光照培養箱中。水培燕麥在脅迫處理0、1、2、4、8、16、24、48和72 h后，剪取葉片，液氮迅速冷凍后-70 ℃保存，用于脅迫表達模式分析，其中脅迫處理 24 h的葉片用于基因克?。淮柙匝帑溦ＩL至苗期、分蘗期、抽穗期、灌漿期和成熟期時，分別收集葉、根、莖和穗組織(抽穗期、灌漿期和成熟期)，液氮迅速冷凍后-70 ℃保存，用于組織表達模式分析。

1.3 燕麥 AsSnRK2.7基因的克隆

表1 本研究所用的引物

1.4 燕麥 AsSnRK2.7基因生物信息學分析

運用ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預測基因的開放閱讀框。采用Translate(https://web.expasy.org/translate/)推導目的基因編碼的氨基酸序列。使用BLASTP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對編碼蛋白進行同源搜索。利用NCBI中的CD-Search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預測編碼蛋白的保守結構域。采用ClustalX軟件進行多序列比對分析，基于輸出的序列比對結果，利用GeneDoc和MEGA 5.1軟件分別進行多重序列比對圖和系統進化樹的繪制。運用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)工具預測蛋白的功能區和激活位點。利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)預測編碼蛋白的理化性質；利用TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)預測編碼蛋白的跨膜結構；利用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)編碼蛋白的疏水性/親水性。用DictyOGlyc 1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/dictyoglyc/)預測編碼蛋白的O-糖基化修飾位點；利用Motif Scan(https://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)預測編碼蛋白的生物活性位點；利用NetPhos 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預測編碼蛋白的磷酸化修飾位點。利用PONDR(http://www.pondr.com/)分析編碼蛋白的無序化；利用TargetP 1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP-1.1/)預測氨基酸序列導肽；利用STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl)預測編碼蛋白的互作蛋白。利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析編碼蛋白的二級結構，利用Phyre 2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)分析編碼蛋白的三級結構，利用PDBsum(http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/Generate.html)檢測模型質量。

1.5 燕麥 AsSnRK2.7基因的亞細胞定位

1.6 燕麥 AsSnRK2.7基因的表達特性分析

2 結果與分析

2.1 燕麥 AsSnRK2.7全長cDNA的克隆結果

以干旱脅迫24 h的燕麥葉片cDNA第一鏈為模板，通過RT-PCR擴增，得到長度約250 bp和1 000 bp的2條cDNA片段(圖1)，其中，1 000 bp的條帶與預期大小一致?；厥臻L度約 1 000 bp的片段，進行T-A克隆后并測序，發現該片段長度為1 074 bp。ORF預測結果表明，該基因包含一個1 074 bp的開放閱讀框，編碼357個氨基酸。BLAST結果顯示，該基因編碼的氨基酸序列與二倍體長穗偃麥草(Thinopyrumelongatum，QDA34118.1)、粗山羊草(Aegilopstauschii，XP_020174011.1)、波蘭小麥(Triticumpolonicum，ALL27274.1)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon，NP_001304805.1)、水稻(Oryzasativa，XP_004975639.1)、谷子(Setariaitalica，XP_004975639.1)、高粱(Sorghumbicolor，XP_021318906.1)和擬南芥(Arabidopsisthaliana，NP_195711.1)SnRK2蛋白激酶氨基酸序列的一致性分別為99.75%、96.92%、96.64%、96.36%、91.64%、90.50%、89.97%和 62.01%。利用NCBI CD-Search在線工具對該基因編碼的蛋白進行功能結構域預測，發現該蛋白含有一個STKc_SnRK2結構域和一個PKc_like superfamily結構域，屬于SnRK2蛋白激酶家族成員(圖2)。將獲得的cDNA片段命名為AsSnRK2.7，提交至Genbank，獲得登錄號為MN729577。

1：cDNA擴增產物；M：Marker DL2000。

圖2 AsSnRK2.7蛋白功能結構域預測結果

2.2 燕麥AsSnRK2.7蛋白多序列比對和系統進化分析

多序列比對結果表明，AsSnRK2.7蛋白與玉米(Zeamays，ACG50009.1)、粳稻(OryzasativaJaponica，BAD17998.1)、波蘭小麥(Triticumpolonicum，ALL27272.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana，NP_567945.1)和二穗短柄草(BrachySnRK2家族成員在C端呈現多變特異性，而在N端表現出高度的保守性(圖3)。

Ⅰ：蛋白激酶ATP結合信號區；Ⅱ：N-肉豆蔻?；饔梦稽c；Ⅲ：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點；Ⅳ：激活環；Ⅴ：跨膜螺旋位點；Ⅵ：響應滲透脅迫所需的結構域Ⅰ；Ⅶ：響應ABA所需的結構域Ⅱ。

進化樹分析表明，來自10個物種的22個SnRK2蛋白被分成3個類群(圖4)。其中，AsSnRK2.7蛋白與普通小麥(Triticumaestivum，ACU65228.1)、波蘭小麥(Triticumpolonicum，AHC00229.1)、玉米(Zeamays，ACG50009.1)、水稻(Oryzasativa，BAD18002.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana，NP_176290.1)、煙草(Nicotianatabacum，AAL89456.1)和馬鈴薯(Solanumtuberosum，AFR68941.1)的7個SnRK2成員親緣關系最近，被聚為Group Ⅰ(SnRK2b)。

圖4 不同物種SnRK2蛋白的聚類分析

2.3 AsSnRK2.7蛋白功能區與生物活性位點的預測

O-糖基化修飾位點預測結果表明，AsSnRK2.7蛋白中第133和307位的氨基酸殘基可能成為O-糖基化修飾的位點。NetPhos預測結果顯示，該蛋白中有12個絲氨酸、9個蘇氨酸和7個絡氨酸殘基可能成為磷酸化修飾的位點。利用Motif Scan在線工具預測AsSnRK2.7生物活性位點，結果表明，該蛋白包含1個酰胺化位點(324～327 aa)、1個cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點(247～250 aa)、5個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(96～99 aa、129～132 aa、172～175 aa、250～253 aa和290～293 aa)、2個N-肉豆蔻酰化作用位點(110～115 aa和239～244 aa)、3個蛋白激酶C磷酸化位點(54～56 aa、172～174 aa和250～252 aa)、2個酪氨酸激酶磷酸化位點(94～102 aa和140～146 aa)、1個蛋白激酶ATP結合信號區(10～33 aa)、1個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(119～131 aa)、富含谷氨酸的區域(318～347 aa)、1個蛋白激酶結構域(4～60 aa)和1個酪氨酸蛋白激酶位點(4～85 aa)。

2.4 燕麥AsSnRK2.7蛋白的理化性質、跨膜結構和疏水性/親水性分析

基于ProtParam工具對AsSnRK2.7蛋白理化性質分析，結果顯示，該蛋白含有20種氨基酸，帶正電氨基酸(Arg+Lys)和負電氨基酸(Asp+Glu)比例分別為13.16%和15.69%，含量較低的2種氨基酸分別為色氨酸(0.8%)和半胱氨酸(2.2%)，含量較高的4種氨基酸分別為谷氨酸(10.4%)、亮氨酸(7.0%)、賴氨酸(7.0%)和丙氨酸(6.4%)；理論等電點為5.63，分子量為 40 914.63。該蛋白總平均疏水性(GRAVY)、脂肪系數和不穩定性系數分別為-0.540、75.94和43.08，是一種親水且不穩定蛋白(總平均疏水性負值是親水蛋白，正值為疏水蛋白；穩定蛋白系數小于40，不穩定蛋白系數大于40)。

利用TMPred在線分析軟件對燕麥AsSnRK2.7蛋白進行跨膜結構分析，結果表明，該蛋白僅存在一個分值大于500的跨膜區域(180～200 aa)，該跨膜區域既有從內到外的跨膜能力(分值991)，又有從外到內的跨膜能力(分值734)，推斷AsSnRK2.7為跨膜蛋白。利用ProtScale在線工具對燕麥AsSnRK2.7蛋白進行疏水性/親水性分析，結果顯示，該蛋白包括明顯的疏水區(分值大于0.5)和親水區(分值小于-0.5)，且疏水區域少于親水區域。此外，組成AsSnRK2.7蛋白的357個氨基酸中，第339和340位氨基酸親水性最強，分值為-3.300；第191和192位氨基酸疏水性最強，分值為2.189。這些結果表明，燕麥AsSnRK2.7可能是一種親水蛋白，與ProtParam在線工具預測結果一致。

2.5 AsSnRK2.7蛋白的固有無序化分析以及導肽和互作蛋白的預測

利用PONDR在線程序對AsSnRK2.7蛋白進行折疊無序化分析，發現AsSnRK2.7是一個部分無序蛋白。AsSnRK2.7蛋白包含6個無序化區域，分別位于3～4 aa、23～36 aa、38～47 aa、159～172 aa、291～304 aa和309～356 aa，最長的無序區域包含48個氨基酸殘基，無序化氨基酸總數為103個，無序化程度為28.85%。

利用TargetP 1.1在線工具對AsSnRk2.7蛋白進行導肽預測，結果表明，燕麥AsSnRK2.7蛋白的分泌途徑信號肽、線粒體目標肽、葉綠體轉運肽和其他位置導肽的預測分值分別為0.026、0.168、0.036和0.891，預測可靠性為2級，不存在導肽酶切位點，不具有導肽性。

利用STRING在線程序預測顯示，在小麥中發現10個與AsSnRK2.7同源蛋白(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)的互作蛋白(圖5)。其中，包含6個堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)轉錄因子、3個胱硫醚-β-合成酶和1個環核苷酸-單磷酸依賴蛋白激酶。

圖5 小麥中AsSnRK2.7同源蛋白的互作蛋白

2.6 AsSnRK2.7蛋白的二級結構和三級結構 分析

AsSnRK2.7蛋白是一種混合型結構的蛋白質，其二級結構主要為α-螺旋和無規則卷曲，分別占38.94%和40.06%，而β-轉角和延伸鏈占比較少，分別為5.60%和15.41%。

由圖6A可以看出，AsSnRK2.7蛋白三級結構主要為無規則卷曲和α-螺旋，與其二級結構預測結果相一致。利用PDBsum，對AsSnRK2.7蛋白三級結構建模結果可靠性進行檢測，結果(圖6B)可以看出，AsSnRK2.7模型氨基酸在最佳允許區(A、B和L區域)、次允許區(a、b、l和p區域)、一般允許區(-a、-b、-l和-p區域)和不允許區的比列分別為64.1%、29.8%、4.8%和 1.3%。在最佳允許區和次允許區的氨基酸的比例為93.9%，說明所構建的AsSnRK20.7蛋白三級結構模型符合立體化學的規則。

A：AsSnRK2.7蛋白的三級結構；B：AsSnRK2.7蛋白模型的拉氏構象。

2.7 AsSnRK2.7蛋白質亞細胞定位分析

從圖7可以看出，在pCAMBIA2300-CaMV35S-GFP轉化的煙草表皮細胞中，綠色熒光信號分布在細胞質、細胞核和細胞膜等區域。而35S-AsSnRK2.7-GFP轉化的煙草表皮細胞中，綠色熒光信號主要分布在細胞核。將GFP、CHI、DAPI以及DIC通道融合后，35S-AsSnRK2.7-GFP融合蛋白所表達的綠色熒光與藍色的DAPI相重合，表明AsSnRK2.7蛋白在煙草表皮細胞中定位于細胞核。

GFP：綠色熒光；CHL:葉綠體自發熒光；DAPI：細胞核特異標記；DIC：微分干涉對比；Merge：疊加場。35S-GFP為空載體，35S-AsSnRK2.7-GFP為包含AsSnRK2.7的融合蛋白載體。標尺=25 μm。

2.8 AsSnRK2.7基因的qPCR表達分析

實時定量PCR結果(表2)顯示，AsSnRK2.7基因在燕麥被檢測組織中為組成型表達。在根組織中，AsSnRK2.7基因在苗期表達量最高，灌漿期次之，成熟期最低。在葉片組織中，AsSnRK2.7基因在分蘗期的表達量最高，分別是苗期、抽穗期、灌漿期和成熟期的5.57、2.61、2.33和20.19倍。在莖和穗組織中，AsSnRK2.7基因表達量分別在抽穗期和灌漿期最高，在成熟期最低。

表2 不同組織中 AsSnRK2.7基因的相對表達量

從表3可以看出，ABA不能激活AsSnRK2.7基因的表達，但其表達積極響應PEG、鹽和低溫(4 ℃)的脅迫。在PEG脅迫下，AsSnRK2.7基因出現了雙峰表達模式，峰值分別出現在2 h和16 h，且在2 h表達量最高。在鹽脅迫下，AsSnRK2.7基因的表達量隨處理時間的延長呈現先上升后下降的趨勢，在4 h達到最高。在低溫脅迫下，AsSnRK2.7基因的表達量在0～4 h持續上調，在16 h達到最高。

表3 不同脅迫下 AsSnRK2.7基因的轉錄水平

3 討 論

SnRK2蛋白激酶基因屬于多基因家族，在水稻[22]、玉米[23]和擬南芥基因組中分別存在10、11和10個AsSnRK2基因[24]。本研究依據干旱脅迫下燕麥轉錄組中的序列信息，利用RT-PCR技術，首次從燕麥中分離出一個SnRK2蛋白激酶基因AsSnRK2.7。AsSnRK2.7基因cDNA長度為1 074 bp，與波蘭小麥[18]和二穗短柄草[19]SnRK2.7基因的開放閱讀框序列長度完全一致。生物信息學分析表明，AsSnRK2.7蛋白含有SnRK2蛋白激酶家族特有的功能域，包括蛋白激酶ATP結合信號區、N-肉豆蔻?；饔梦稽c、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點、激活環、跨膜螺旋位點和響應滲透脅迫所需的結構域Ⅰ等重要功能區，表明不同植物中SnRK2蛋白激酶成員結構十分保守，這與前人在小麥[6-7]、波蘭小麥[18]和二穗短柄草[19]中的研究結果一致。

N-肉豆蔻?；饔梦稽c和跨膜區是蛋白質在植物應答環境脅迫反應中調節膜靶向和信號轉導的關鍵區域[25-26]。TaSnRK2.4、TaSnRK2.7和TaSnRK2.8蛋白均定位在細胞膜、細胞質和細胞核中，且過表達這3個基因均能增強擬南芥對干旱、鹽和冷脅迫的耐受性[7，27-28]。TaSnRK2.4、TaSnRK2.7和 TaSnRK2.8蛋白中均存在一個潛在的N-肉豆蔻酰化作用位點和一個潛在的跨膜區，表明SnRk2s可能與細胞膜或核受體結合而相互作用[7,27-28]。本研究發現，AsSnRK2.7蛋白中也存在一個潛在的N-肉豆蔻?；饔梦稽c和一個潛在的跨膜區，但僅定位在細胞核中。

盡管在5個發育階段的根、葉、莖和穗(抽穗期、灌漿期和成熟期)組織中均能檢測到AsSnRK2.7基因的表達，但在不同發育階段的不同組織中，AsSnRK2.7基因的相對表達量不同，這與小麥中SnRK2成員研究的報道一致。如小麥TaSnRK2.7基因的表達量在苗期的根組織中較高，而在苗期的葉片、孕穗期的穗和抽穗期的劍葉組織中較低[28]。TaSnRK2.4基因在孕穗期的穗中表達量較高，在苗期的根和抽穗期的劍葉中次之，而在苗期的葉片中最低[27]。這些結果表明，SnRK2基因存在著明顯的空間和時間上的表達差異，在正常生長條件下調節不同生理代謝過程。

根據C末端富集的酸性氨基酸的類型，SnRK2蛋白激酶可分為兩個亞組：富含天冬氨酸的SnRK2a(為ABA依賴型SnRK2s)和富含谷氨酸的SnRK2b(為非ABA依賴型SnRK2s)[2,29]。根據序列相似性、功能域結構和細胞功能，植物SnRK2亞家族可分為三個亞組：Group Ⅰ、Group Ⅱ和Group Ⅲ，其中，Group Ⅱ和Group Ⅲ兩個亞組屬于SnRK2a，而Group Ⅰ屬于SnRK2b[1]。Group III中的SnRK2成員對ABA具有強烈的響應，Group II成員不受或微弱受ABA激活，Group I成員不被ABA脅迫誘導，而Group Ⅰ、Group Ⅱ和Group Ⅲ成員均受滲透脅迫的激活[22,24]。本研究發現，AsSnRK2.7屬于Group I(SnRK2b)中成員，對外源ABA的誘導不敏感，說明AsSnRK2.7蛋白激酶可能是一個非ABA依賴型SnRK2成員，這與Group I成員不被ABA脅迫誘導的研究結果一致。然而，在玉米中ZmSnRK2.4、ZmSnRK2.5、ZmSnRK2.7和小麥中的TaSnRK2.4也屬于Group I成員，但卻能被ABA脅迫誘導[23,27]。此外，在本研究中，AsSnRK2.7基因能夠積極應答低溫、鹽和PEG脅迫，表明AsSnRK2.7基因同其他SnRK2成員一樣在植物信號轉導和脅迫耐受性中起關鍵作用。然而，前人研究表明，ZmSnRK2.7基因不含低溫應答元件(LTRE)，但仍可被冷脅迫所誘導[23]。所以，非ABA依賴型SnRK2基因結構與其受逆境脅迫應答的關系還需進一步深入研究。

已有研究表明，SnRK2蛋白激酶N端激活環上絲氨酸殘基的可逆磷酸化可調控SnRK2活性[31-33]。目前對于非ABA依賴型SnRK2的可逆磷酸化報道較少，但有關ABA依賴型SnRK2的可逆磷酸化的研究較多。SnRK2蛋白激酶在響應滲透脅迫與ABA過程中自身磷酸化機制不同，滲透脅迫誘導的磷酸化水平普遍高于ABA誘導的磷酸化水平，另外在滲透脅迫下不同的SnRK2蛋白激酶的磷酸化水平也不同[31]。煙草中的NtOSAK和擬南芥中的SnRK2.10均屬于GroupI，為響應滲透脅迫的非ABA依賴型SnRK2成員，這2個蛋白激酶激活環中均存在2個蛋白磷酸化位點，且這2個位點的可逆磷酸化均可調節激酶活性，并存在順序性，其中一個絲氨酸的磷酸化是另一個絲氨酸磷酸化所必需的[29-30]。然而，Group III中擬南芥ABA依賴型激酶則是通過2個位點單獨磷酸化來調控激酶活性[30]。本研究基于NetPhos在線分析，發現AsSnRK2.7蛋白質的激活環(ICDFGYSKSSLLHSKPKSTVGTPAYIAPE)上存在2個可逆的蛋白質磷酸化殘基(帶下劃線的氨基酸殘基)，分別位于Ser-154和Ser-158，但其激活環上的2個磷酸化位點磷酸化是否對AsSnRK2.7蛋白激酶活性調控具有協同作用，還需進一步的研究。

SnRK2蛋白激酶可通過磷酸化作用來影響下游底物的活性。SnRK2蛋白激酶如SnRK2.2/SRK2D、SnRK2.6/SRK2E和SnRK2.3/SRK2I可以在體外磷酸化擬南芥AREB1蛋白[11]。目前，植物中僅有少數蛋白被被證實為SnRK2蛋白激酶的底物，包括轉錄bZIP型轉錄因子ABF/AREB和AP2/ERF-型轉錄因子DREB[15,17]。此外，Wang等[16]通過定量磷酸化蛋白組學鑒定了一些SnRK2s底物，這些SnRK2s底物包括參與開花時間調控、RNA和DNA結合、miRNA和表觀遺傳調控、信號轉導(ABF2、AREB3、TAF5、EEL和FBH3等)、葉綠體功能及許多其他細胞過程的蛋白質。本研究使用STRING在線程序在小麥中找到與AsSnRK2.7同源蛋白可能存在互作關系的蛋白，包括bZIP轉錄因子、胱硫醚-β-合成酶和環核苷酸-單磷酸依賴蛋白激酶。這些蛋白對植物抗逆性有重要影響，因此，這些蛋白的發現將為利用燕麥AsSnRK2.7基因來改善植物的抗逆性提供理論基礎。