飛蝗核受體基因LmE75的分子特性和功能分析

劉曉健，郭俊，2，張學(xué)堯，馬恩波，張建珍

飛蝗核受體基因的分子特性和功能分析

劉曉健1，郭俊1，2，張學(xué)堯1，馬恩波1，張建珍1

（1山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所，太原 030006；2山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006）

【】核受體（nuclear receptor，NR）是一類配體依賴型的轉(zhuǎn)錄因子，在昆蟲生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，本文以重要農(nóng)業(yè)害蟲飛蝗（）為研究對象，分析核受體基因的分子特性以及功能，為害蟲防治提供新分子靶標(biāo)。基于飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫獲得3條的cDNA序列，運用Blast和ExPASy網(wǎng)站中相關(guān)軟件分析各個基因的開放閱讀框、預(yù)測氨基酸序列、理化特性及保守結(jié)構(gòu)域；使用MEGA 6.0 軟件中鄰接法（neighbor-joining，NJ）與其他昆蟲同源序列進行聚類分析。利用Primer 3.0軟件設(shè)計3個亞型的特異性表達引物，運用 reverse transcription-quantitative PCR（RT-qPCR）技術(shù)分析3個亞型在5齡若蟲不同組織及4—5齡不同發(fā)育日齡的表達特性。體內(nèi)注射蛻皮激素（20-hydroxyecdysone，20E）誘導(dǎo)和干擾20E受體基因的表達后，RT-qPCR檢測的表達，明確是否受20E調(diào)控。利用RNAi（RNA interference）技術(shù)，將體外合成的亞型共同區(qū)域的dsRNA注射至5齡飛蝗若蟲體內(nèi)，48 h后提取體壁RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，運用RT-qPCR技術(shù)檢測亞型的沉默效率并觀察表型；之后進一步利用H&E（hematoxylin and eosin）染色方法觀察對飛蝗表皮結(jié)構(gòu)的影響。基于飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫獲得3條的cDNA序列，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征命名為、和，GenBank登錄號分別為MN584732、 MN584733和MN584734。3個LmE75亞型均具有典型的核受體結(jié)構(gòu)域，其中DBD（DNA binding domain）和LBD（ligand binding domain）在各昆蟲中高度保守；E75聚類分析結(jié)果顯示不同目的昆蟲類群E75亞型優(yōu)先聚為一支；RT-qPCR結(jié)果顯示3個亞型具有不同的組織和發(fā)育表達特性。在體壁和肌肉中高表達；在體壁中高表達，其次是前腸；特異性在體壁高表達；在4齡和5齡期均呈現(xiàn)先升高后降低的表達趨勢；在N4D3和N5D5表達量最高，蛻皮前后表達量均較低；在4齡和5齡期均呈現(xiàn)逐漸升高的表達趨勢，在蛻皮前表達量最高。20E誘導(dǎo)3 h和6 h后，處理組的表達量較對照組分別上調(diào)了4.2倍和4.5倍。利用RNAi技術(shù)干擾48 h后的表達量較對照組下調(diào)59%，表明受20E調(diào)控。在5齡第1天注射ds后的飛蝗具有明顯的發(fā)育延遲現(xiàn)象，若蟲無法蛻皮至成蟲并最終100%死亡。體壁H＆E染色結(jié)果顯示，注射ds組飛蝗沒有發(fā)生皮層溶離現(xiàn)象。飛蝗中有3個亞型，三者具有不同的組織和發(fā)育表達特性；RNAi試驗表明，在飛蝗蛻皮過程中發(fā)揮重要作用。

飛蝗；核受體；；蛻皮激素；RNA干擾

0 引言

【研究意義】核受體（nuclear receptor，NR）是一類在生物體中廣泛分布的配體依賴型的轉(zhuǎn)錄因子[1]，可通過多個信號途徑調(diào)控機體的胚胎及胚后發(fā)育、衰老、晝夜節(jié)律等生命過程[2]。飛蝗（）是重要的農(nóng)業(yè)害蟲，圍繞其核受體基因開展研究工作，對闡明核受體在飛蝗蛻皮過程中的作用機制以及基于RNA干擾（RNAi）的飛蝗防治具有重要意義。【前人研究進展】昆蟲經(jīng)過變態(tài)發(fā)育獲得飛翔和生殖能力[3]。前胸腺分泌的蛻皮激素（20-hydroxyecdysone，20E）與咽側(cè)體分泌的保幼激素（juvenile hormone，JH）是昆蟲變態(tài)的主要因素[4]。蛻皮激素20E調(diào)控昆蟲蛻皮的分子機制已在完全變態(tài)昆蟲中有較多研究，20E與蛻皮激素受體（EcR）和超氣門蛋白（USP）的復(fù)合物結(jié)合成為三聚體，啟動一系列下游轉(zhuǎn)錄因子的表達，進而調(diào)控昆蟲蛻皮等生理活動[5]。參與20E信號傳導(dǎo)的基因包括轉(zhuǎn)錄因子E74、Broad和一些核受體。核受體含有5個典型結(jié)構(gòu)域：A/B域（轉(zhuǎn)錄激活域，trans-activation domain）、C域（DNA結(jié)合域，DNA binding domain，DBD）、D域（鉸鏈域，hinge domain）、E域（配體結(jié)合域，ligand binding domain，LBD）和F域。可分為7個亞家族：NR0、NR1、NR2、NR3、NR4、NR5和NR6[6]。E75核受體屬于NR1亞家族，命名為NR1D3。在黑腹果蠅（）中研究發(fā)現(xiàn)，有4個亞型，是20E信號傳導(dǎo)通路的早期響應(yīng)基因，其純合的缺失品系致使1齡幼蟲期發(fā)育延遲，不能蛻皮為2齡幼蟲而死亡[7]。迄今為止，已在埃及伊蚊（）[8]、煙草天蛾（）[9]、大蠟螟（）[10]、云杉芽卷蛾（）[11]、家蠶（）[12]、印度谷螟（）[13]、西方蜜蜂（）[14]、赤擬谷盜（）[15]、馬鈴薯甲蟲（）[16]、德國小蠊（）[17]等多種昆蟲中克隆獲得。已有研究表明在昆蟲生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，如德國小蠊中有5個亞型，注射共同區(qū)域的dsRNA后大部分個體無法正常蛻皮而死亡[17]。馬鈴薯甲蟲中有3個亞型，各亞型均受20E調(diào)控，利用RNAi技術(shù)將沉默后可影響蛻皮激素20E和保幼激素JH的滴度從而調(diào)控蛻皮激素和保幼激素信號途徑，最終導(dǎo)致馬鈴薯甲蟲化蛹困難而死亡[16]。【本研究切入點】目前在完全變態(tài)昆蟲的研究中取得了較大進展[7-16]，但該基因在不完全變態(tài)昆蟲飛蝗中的作用機制有待深入解析。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過RNAi結(jié)合H&E染色方法分析飛蝗核受體基因5的生物學(xué)功能，豐富蛻皮激素調(diào)控昆蟲蛻皮的理論體系，為基于RNAi的害蟲控制提供新的靶標(biāo)基因。

1 材料與方法

試驗于2018—2019年在山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所完成。

1.1 供試?yán)ハx

飛蝗蟲卵由河北省滄州市建民蟲業(yè)公司提供。將蟲卵置于孵化盒中進行孵化，期間噴灑適量水以保持沙土潮濕，孵化出的1齡若蟲轉(zhuǎn)移至25 cm×25 cm×25 cm的紗籠中，置于溫度為（30±2）℃，相對濕度為（40±10）%，光照14 h、黑暗10 h的養(yǎng)蟲室中，飼喂新鮮的小麥苗，待其生長發(fā)育至3齡若蟲期開始輔以麥麩飼喂。

1.2 LmE75 cDNA序列分析

1.2.1cDNA序列搜索及分析 通過搜索飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫獲得3條的cDNA序列。利用NCBI中的Open Reading Frame Finder（ORF Finder）（http://cms.ncbi.nlm.nih.gov/orf finder/）軟件找到的全長開放閱讀框。利用ExPASy網(wǎng)站中（https://www.expasy.org/）相關(guān)軟件對各個基因的開放閱讀框序列進行翻譯、預(yù)測各蛋白分子量（Mw）及等電點（pI）。SMART（http://smart. embl-heidelberg. de/）分析預(yù)測其蛋白結(jié)構(gòu)域。運用GENEDOC軟件將、和特異性的A/B域核苷酸進行比對，分析三者的核苷酸一致度；運用GENEDOC軟件將、和氨基酸序列與馬鈴薯甲蟲（、和）和德國小蠊（、和）氨基酸序列進行比對，分析其DNA結(jié)合域（DBD）和配體結(jié)合域（LBD），而兩個結(jié)構(gòu)域通過不保守的絞鏈結(jié)構(gòu)域連接。

1.2.2 昆蟲E75系統(tǒng)發(fā)育分析 在NCBI網(wǎng)站上下載其他物種E75蛋白的同源序列，運用MEGA 6.0軟件中NJ（neighbor-joining）法構(gòu)建不同昆蟲E75的系統(tǒng)進化樹。不同昆蟲E75的GenBank登錄號見表1。

1.3 LmE75亞型在不同組織及發(fā)育時期的表達特性分析

1.3.1 樣品收集 為了研究亞型在不同組織和發(fā)育時間的表達特性，選用5齡第2天（N5D2）飛蝗若蟲，在體視顯微鏡下解剖觸角、腦、前腸、胃盲囊、中腸、后腸、精巢、卵巢、體壁、脂肪體、肌肉和翅12個組織；選取4—5齡每天（N4D1—N4D5和N5D1—N5D7）若蟲第2—3腹節(jié)處體壁立即凍存于液氮中，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｒ陨纤袠悠肪?個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)至少4頭若蟲。

1.3.2 總RNA提取、cDNA合成及RT-qPCR 提取上述組織與發(fā)育時間的樣品總RNA，具體步驟均按照 RNAisoTMPlus（TaKaRa）試劑說明書操作，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取RNA的質(zhì)量，利用NanoDrop 2000定量各樣品的RNA濃度，并檢驗A260/A280和A260/A230的值。以1 μg總RNA為模板，根據(jù)Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，合成cDNA。運用Primer 3.0軟件設(shè)計3個亞型的特異性表達引物，以作為內(nèi)參[18-19]，引物信息見表2。利用RT-qPCR方法檢測和在不同組織和發(fā)育時間的表達特性。在Applied Biosystems 7300 real-time PCR system上進行RT-qPCR，PCR反應(yīng)體系按照SYBR ? Green real-time PCR Master Mix（TaKaRa）說明書進行配置，擴增程序第一步為預(yù)變性10 min，第二階段為95℃ 15 s，退火溫度60℃ 1 min，40個循環(huán)；DNA熔解曲線為65—95℃，每步上升1℃。每個樣品均設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)和2 個技術(shù)重復(fù)，基因相對表達量采用2-ΔCt法[20]進行分析，每個組織與發(fā)育時間點的數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS中的 Tukey’s HSD 進行差異顯著性檢驗，柱形圖上不同字母代表基因表達差異顯著。

表1 本研究中用于構(gòu)建系統(tǒng)進化樹的物種和E75的 GenBank 登錄號

表2 所用RT-qPCR和RNAi的引物信息

T7序列T7 sequence: taatacgactcactataggg

1.4 20E誘導(dǎo)表達分析

1.4.1 20E誘導(dǎo) 為了檢測對20E誘導(dǎo)的響應(yīng)，配置10%的乙醇并將20E（Sigma）稀釋至濃度為5 μmol·L-1保存?zhèn)溆茫唧w參考文獻[21]的方法；挑取健康的5齡第2天（N5D2）若蟲注射10 μg 20E，同時注射等體積的10%的乙醇作為對照組，分別在注射3、6、12 h后取飛蝗第2—3體節(jié)的體壁提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。每個時間點的對照組和處理組均設(shè)置5個生物學(xué)重復(fù)，4頭試蟲為1個生物學(xué)重復(fù)，共計20頭試蟲。采用RT-qPCR方法檢測在對照組和20E處理組各時間點中的表達量。

1.4.2 干擾20E核受體后的表達變化 為了進一步檢測響應(yīng)20E誘導(dǎo)表達情況，首先合成的dsRNA，具體參考文獻[22]的方法。在N5D2若蟲注射10 μg雙鏈 RNA（ds），以注射的雙鏈RNA（ds）作為對照組。注射48 h后取飛蝗第2—3體節(jié)的體壁提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。對照和注射ds組均設(shè)置5個生物學(xué)重復(fù)，4頭試蟲為1個生物學(xué)重復(fù)，共計20頭試蟲。采用RT-qPCR方法檢測和的表達量。1.4.1和1.4.2的數(shù)據(jù)采用student-test方法進行差異表達分析，*、**和***分別表示在＜0.05、＜0.01、＜0.001水平差異顯著。

1.5 基于RNAi的LmE75功能分析

1.5.1 dsRNA合成與注射 根據(jù)3個亞型共同區(qū)域的核苷酸序列，在E-RNAi（http://www.dkfz.de/ signaling/e-rnai3/idseq.php）網(wǎng)站設(shè)計dsRNA引物，引物信息見表2。以稀釋后的和質(zhì)粒DNA分別為模板進行PCR擴增以獲得用于體外轉(zhuǎn)錄dsRNA的模板，按照2×Taq PCR MasterMix（TIANGEN）說明書進行PCR反應(yīng)體系的配置及反應(yīng)程序的設(shè)置。PCR產(chǎn)物的回收純化按照FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit（Vazyme）說明書操作，之后用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增條帶的單一性。利用純化后的DNA產(chǎn)物為模板，參照T7 RiboMAXTMExpress RNAi System（Promega）試劑盒說明書步驟分別合成和的dsRNA，利用NanoDrop 2000定量各樣品的dsRNA濃度和純度。用ddH2O將合成的dsRNA稀釋至終濃度為2 μg·μL-1，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｌ羧5D1的若蟲進行ds和ds的注射。每頭試蟲的dsRNA注射量均為10 μg，設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，20頭若蟲為1個生物學(xué)重復(fù)，共計60頭試蟲。注射完畢后，將所有試蟲放置于養(yǎng)蟲室內(nèi)細(xì)心飼養(yǎng)用于后續(xù)試驗。

1.5.2 RNAi后表達量檢測及表型觀察 注射ds和ds48 h后分別收集對照組和處理組的第2—3體節(jié)體壁提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用 RT-qPCR方法檢測的沉默效果，設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，每組3頭試蟲，2個技術(shù)重復(fù)，RT-qPCR方法與1.3的檢測方法相同，采用2-ΔCt法對的相對表達量進行計算，數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計方法參考1.4，剩余試蟲用來觀察表型并拍照。

1.5.3 H＆E 染色 為了觀察干擾后對飛蝗表皮形成的影響，分別解剖對照組脊線開裂時若蟲和處理組相應(yīng)時間點以及最終死亡時的飛蝗體壁組織。取其第4—5腹節(jié)體壁，用3%戊二醛固定，4℃過夜以制備石蠟切片。固定后的體壁樣品經(jīng)過脫水和石蠟包埋后進行5 μm切片，蘇木精和伊紅（H＆E）進行染色，具體方法參照文獻[23]，封片后利用Olympus BX51顯微鏡（Japan）觀察注射ds和ds的體壁結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 LmE75序列特性

根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征，將獲得的3個飛蝗命名為、和，GenBank登錄號分別為MN584732、MN584733和MN584734。、和的cDNA序列長度分別為2 238、2 280和2 271 bp，編碼745、759和756個氨基酸；使用ExPaSy網(wǎng)站上的相關(guān)軟件預(yù)測蛋白分子量及等電點，LmE75A、LmE75B和LmE75C的相對分子量分別為81.60、82.55和82.37 kD，其pI均為堿性，分別為8.43、8.08和8.32。3個LmE75亞型具有典型的核受體結(jié)構(gòu)域：A/B域、C域（DBD）、D域、E域（LBD）和F域（圖1-A）。飛蝗3個E75亞型N端A/B域有較小的差異，和以及的A/B域核苷酸一致度為45.0%和47.7%，和的A/B域核苷酸一致度為64.1%（圖1-B）。LmE75A、LmE75B和LmE75C的DBD和LBD結(jié)構(gòu)域與其他昆蟲的DBD和LBD結(jié)構(gòu)域具有高度一致度，其中DBD結(jié)構(gòu)域包含兩個鋅指區(qū)域，每一個具有4個半胱氨酸殘基，LBD結(jié)構(gòu)域中包含4個參與血紅素結(jié)合的重要氨基酸殘基（圖1-C）。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

E75的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，發(fā)育樹分別形成了鞘翅目類群、半翅目類群、蜚蠊目類群、膜翅目類群、直翅目類群、鱗翅目類群和雙翅目類群，其中半翅目類群分為兩支，綠盲蝽（）和溫帶臭蟲（）的E75聚為一支，褐飛虱（）兩個E75亞型單獨聚為一支，鱗翅目類群和雙翅目類群進而形成長翅亞群總支，飛蝗中的3個LmE75亞型屬于直翅目類群（圖2）。

A：3個LmE75亞型結(jié)構(gòu)域分析Domain structure analysis of the three LmE75 nuclear receptor isoforms；B：3個LmE75亞型A/B域核苷酸序列比對Nucleotide alignment of the A/B domain of three LmE75 isoforms；C：LmE75亞型氨基酸序列與馬鈴薯甲蟲和德國小蠊E75多重比對Multiple alignment of LmE75 isoforms with E75 of L. decemlineata and B. germanica。在序列的上方標(biāo)記DNA結(jié)合域、鉸鏈域和配體結(jié)合域。序列下方的圓圈指示鋅指中的4個Cys殘基，三角形標(biāo)記參與血紅素結(jié)合的重要氨基酸殘基The DNA binding domain, hinge domain and ligand binding domain are tagged above the sequence, the circles indicate that there are four Cys residues in the zinc finger, and the important amino acid residues involved in heme binding are marked with triangles

圖2 昆蟲E75系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3 LmE75亞型基因組織和時期表達特性

RT-qPCR分析結(jié)果表明3個亞型具有不同的組織和發(fā)育表達特性。在體壁和肌肉中高表達；在體壁中高表達，其次是前腸；特異性在體壁高表達；在4齡和5齡均呈現(xiàn)先升高后降低的表達趨勢，在N4D3—N4D4以及N5D4—N5D6表達量最高；在4齡和5齡的表達趨勢一致，均在齡期中一天表達量最高（N4D3和N5D5），蛻皮前后表達量均較低；在4齡和5齡均呈現(xiàn)逐漸升高的表達趨勢，在蛻皮前表達最高（圖3）。

2.4 20E誘導(dǎo)表達及LmEcR RNAi后LmE75的表達變化

為了檢測是否受20E誘導(dǎo)，選取N5D2的飛蝗若蟲進行了20E和ds注射，RT-qPCR結(jié)果如圖所示，與對照組相比，在20E誘導(dǎo)3 h和6 h后表達量顯著上調(diào)，分別上調(diào)了4.2倍和4.5倍（圖4-A）；注射ds48 h后的沉默效率為83%，的表達量亦顯著被抑制，與對照組相比其表達量下調(diào)了59%（圖4-B）。

2.5 基于RNAi的LmE75的生物學(xué)功能

RT-qPCR的結(jié)果顯示，注射ds的飛蝗與注射ds對照組相比被顯著沉默（圖5-A）。對照組7 d羽化為成蟲，而注射ds組7 d后飛蝗進食較對照組明顯減少，活動力下降，且100%出現(xiàn)嚴(yán)重的發(fā)育延遲現(xiàn)象，5齡若蟲期長達13—18 d，并未出現(xiàn)蛻皮跡象，死亡時外形無顯著變化（圖5-B）。體壁H＆E染色的結(jié)果顯示，對照組脊線開裂時有皮層溶離現(xiàn)象，舊表皮降解，新表皮明顯形成。ds處理組則未觀察到皮層溶離，舊表皮不降解，亦無新表皮的形成（圖5-C）。

3 討論

本研究基于飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫搜索獲得的3條cDNA序列，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征分別命名為、和。在黑腹果蠅[7]、家蠶[24]、赤擬谷盜[15]、馬鈴薯甲蟲[16]和德國小蠊[17]等昆蟲中也發(fā)現(xiàn)具有不同數(shù)量的亞型，如馬鈴薯甲蟲中有3個亞型，黑腹果蠅有4個亞型，德國小蠊有5個亞型。的3個亞型具有典型的核受體結(jié)構(gòu)域：一個非依賴配體的激活結(jié)構(gòu)域（A/B結(jié)構(gòu)域）、DNA結(jié)合域（DBD，C結(jié)構(gòu)域）、鉸鏈連接域（D結(jié)構(gòu)域）、配體結(jié)合域（LBD、E結(jié)構(gòu)域）和F結(jié)構(gòu)域。飛蝗、和中，A/B結(jié)構(gòu)域分別由40、54和51個氨基酸組成，A/B結(jié)構(gòu)域在核受體成員間高度可變，表明其來源于同一個基因的不同剪切方式。飛蝗的3個亞型與其他昆蟲的DBD和LBD結(jié)構(gòu)域具有高度一致度，DBD結(jié)構(gòu)域中包含兩個鋅指區(qū)域，有研究報道其中的4個半胱氨酸殘基可參與單個鋅原子與激素響應(yīng)原件DNA序列上的結(jié)合[25]，也有一些昆蟲如馬鈴薯甲蟲中只有一個鋅指區(qū)域。果蠅E75是血紅素傳感器，位于LBD結(jié)構(gòu)域的血紅素中心能與雙原子分子（CO或NO）結(jié)合[26]，并且含有4個參與血紅素結(jié)合的重要氨基酸殘基，其中第1和第3個半胱氨酸殘基以及第4個組氨酸在飛蝗中是保守的。

本文采用RT-qPCR技術(shù)研究了3個亞型在5齡飛蝗不同組織中的表達特性，結(jié)果表明3個亞型具有不同的組織表達特性。在體壁和肌肉中高表達；在體壁中高表達，其次是前腸；特異性在體壁高表達；在體壁中特異性高表達，推測該基因可能參與了飛蝗表皮的發(fā)育過程。的多組織分布特性在家蠶[24]、黑腹果蠅[27]、煙草天蛾[28]和馬鈴薯甲蟲[16]中也有報道，但不同昆蟲亞型的表達特性有所不同，如馬鈴薯甲蟲中3個亞型均在體壁低表達，而在馬氏管、中腸、腹神經(jīng)節(jié)、腦-心側(cè)體-咽側(cè)體復(fù)合體等多個組織高表達[16]。時期表達分析發(fā)現(xiàn)，3個亞型在飛蝗若蟲期的表達量并不一致，和在4齡和5齡均為蛻皮前后表達量均較低，但表達量高于；在4齡和5齡蛻皮前表達量最高。家蠶中3個亞型也表現(xiàn)出不同的發(fā)育表達模式[24]，而在馬鈴薯甲蟲中，3個亞型具有相似的發(fā)育表達特性[16]，表明不同昆蟲轉(zhuǎn)錄本在各齡期可能發(fā)揮著不同的功能，從而共同完成的功能。在5齡若蟲中期表達量較高，這一表達模式與20E滴度[22]正相關(guān)，推測的表達可能受20E的調(diào)控。事實上，體內(nèi)注射20E誘導(dǎo)3 h和6 h后均顯著上調(diào)，沉默20E受體基因后表達顯著下調(diào)。類似結(jié)果在其他昆蟲中也有報道，如家蠶中3個亞型均在mRNA和蛋白水平表現(xiàn)出對20E的響應(yīng)[24]。馬鈴薯甲蟲中，體內(nèi)注射20E和體外中腸培養(yǎng)均表明20E可直接誘導(dǎo)和表達[16]。德國小蠊中，解剖脂肪體進行體外組織培養(yǎng)，加入20E后可誘導(dǎo)的4個亞型（、、）表達[17]。

圖4 20E誘導(dǎo)及干擾LmEcR后LmE75的表達

OC：舊表皮old cuticle；NC：新表皮new cuticle；EC：皮細(xì)胞層epidermal cell；NA：無皮層溶離 No apolysis

目前僅在黑腹果蠅[7]德國小蠊[17]和褐飛虱[29]中報道了亞型的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)亞型功能存在冗余現(xiàn)象，如德國小蠊不同轉(zhuǎn)錄本RNAi均能下調(diào)各自靶基因的表達量，但其他轉(zhuǎn)錄本上調(diào)，最終沒有可見表型出現(xiàn)。因此本文選擇3個亞型共同區(qū)域設(shè)計dsRNA，以全部沉默3個轉(zhuǎn)錄本進一步研究在飛蝗中的生物學(xué)功能，ds注射至5齡第1天后飛蝗出現(xiàn)發(fā)育延遲現(xiàn)象，死亡率達100%，且體壁無皮層溶離現(xiàn)象。類似表型也見于其他昆蟲，如赤擬谷盜在幼蟲階段沉默后，一部分幼蟲在靜息階段死亡，另一些幼蟲在蛻皮時死亡[15]。在德國小蠊中，注射ds的6齡若蟲可存活長達80 d，最終不能蛻皮為成蟲而死亡[17]。馬鈴薯甲蟲中通過調(diào)節(jié)20E和JH的滴度影響其信號傳導(dǎo)通路，沉默后導(dǎo)致個體不能正常化蛹，在入土18 d后，大多數(shù)個體死亡[16]。以上研究表明功能在完全變態(tài)和不完全變態(tài)昆蟲中是保守的。

蛻皮是昆蟲等特有的生命現(xiàn)象，表皮是昆蟲體壁的典型結(jié)構(gòu)，脂類、蛋白質(zhì)以及幾丁質(zhì)是其主要成分，并且昆蟲蛻皮受激素調(diào)控。解析昆蟲蛻皮發(fā)育關(guān)鍵基因的功能是RNAi技術(shù)應(yīng)用于害蟲防治的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，目前關(guān)于飛蝗蛻皮發(fā)育相關(guān)基因的研究主要集中在以下幾個方面：（1）蛻皮激素和保幼激素信號通路相關(guān)基因，如蛻皮激素受體EcR[22]、核受體HR3[30]和HR39[31]等；（2）表皮脂代謝關(guān)鍵基因，如表皮碳?xì)浠衔锖铣傻幕騕32]、參與表皮脂轉(zhuǎn)運的基因[33]等；（3）幾丁質(zhì)代謝以及排布關(guān)鍵基因，如幾丁質(zhì)合成酶1[34]、幾丁質(zhì)酶5[21]、幾丁質(zhì)脫乙酰基酶基因[35]等；（4）表皮蛋白基因，如ACP7[36]等。本文研究的E75是蛻皮激素信號通路中的關(guān)鍵核受體基因，基因沉默可導(dǎo)致飛蝗100%不蛻皮死亡，比較這些基因作用機制以及RNAi效果的差異可為篩選更合適的害蟲控制靶標(biāo)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

4 結(jié)論

飛蝗核受體有3個亞型，均具有典型的核受體結(jié)構(gòu)域。3個亞型基因具有不同的組織和發(fā)育表達特性。體內(nèi)20E誘導(dǎo)及RNAi試驗表明，受介導(dǎo)的20E信號通路調(diào)控。基于RNAi功能分析發(fā)現(xiàn)，顯著沉默后飛蝗發(fā)育延遲導(dǎo)致100%不蛻皮死亡。

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Molecular Characteristics and Function Analysis of Nuclear Receptor Gene

LIU XiaoJian1, Guo Jun1,2, Zhang Xueyao1, MA Enbo1, ZHANG Jianzhen1

(1Research Institute of Applied Biology, Shanxi University, Taiyuan 030006;2College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006)

【】Nuclear receptors (NRs) act as ligand-inducible transcription factors, which play an important role during growth and development in insects.is an important agricultural pest. The objective of this study is to analyze the molecular characteristics and biological function of the nuclear receptor gene, and to provide a new molecular target for pest control.【】The cDNA sequences of threegenes were obtained based on the transcriptome database of. The open reading frames, predicted amino acid sequences, physicochemical properties and conserved domains of each gene were analyzed using Blast and ExPASy websites. Using MEGA 6.0 software, the neighbor-joining (NJ) method was used to construct a phylogenetic tree with the homologous sequences of E75 from other insects. Specific primers of threeisoforms were designed using Primer 3.0 software. Reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR) was used to analyze the expression characteristics of threeisoforms in different tissues and developmental days from 4th to 5th instar nymphs. To further test whetherwas regulated by 20-hydroxyecdysone (20E), the expression ofwas detected by RT-qPCR after injected with 20Eandinterfered with the 20E receptor geneby RNAi. The double-stranded RNA (dsRNA) of the common region of threeisoforms was synthesized,and then was injected into the 5th instar nymphs. The total RNA of integument was extracted after 48 h, and the first strand cDNA was synthesized as the template of RT-qPCR. The silencing efficiency ofwas detected by RT-qPCR technology and the phenotype was observed. The effect on the structure of cuticle after injected with dswas analyzed by H&E staining method.【】Three cDNA sequences ofwere obtained based on the transcriptome database of. According to structural characteristics, they were named,and, respectively. The GenBank accession numbers were MN584732, MN584733 and MN584734. Each of the three LmE75 isoforms had typical nuclear receptor conserved domains, and DBD (DNA binding domain) and LBD (ligand binding domain) were highly conserved among insects. Phylogenetic tree analysis showed that E75 isoforms of different orders of insects were preferentially clustered into one group. RT-qPCR results showed that threeisoforms had different tissue and developmental expression characteristics.was highly expressed in the integument and muscle.was highly expressed in the integument, followed by the foregut.was specifically expressed in the integument. The expression level ofincreased first and then decreased at the 4th and 5th instar nymphs. The expression levels ofwere the highest in N4D3 and N5D5, and lower before and after molting. The expression level ofincreased gradually at both the 4th and 5th instar nymphs, with the highest expression before molting. Compared with the control group, the expression level ofsignificantly increased by 4.2 and 4.5 times after 20E induction for 3 h and 6 h, respectively. The expression level ofwas significantly down-regulated by 59% after interference withfor 48 h by RNAi. After injection of dson the 1st day of 5th instar nymphs,exhibited obvious developmental delay phenotype and allcould not molt to adults. The H&E staining of the integument found that the cuticle of ds-injectedshowed no apolysis.【】There are threeisoforms in, and they have different tissue and developmental expression characteristics. RNAi results show thatplay an important role in the molting of

; nuclear receptor (NR);; 20-hydroxyecdysone (20E); RNA interference (RNAi)

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.11.008

2019-10-30；

2019-12-10

國家自然科學(xué)基金（31402020，31872010）、山西省高校科技創(chuàng)新項目（2016113）、山西省面上青年基金項目（201601D021120）

劉曉健（通信作者），E-mail：xiaojianliu@sxu.edu.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）