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利用“藍白斑篩選”高效融合微生物學和基因工程實驗*

2020-07-31 02:15:16趙逸歐劉長付
生物學通報 2020年7期
關鍵詞:實驗

孫 娟 趙逸歐 劉長付

(1 北京市第五十七中學 北京 100038 2 首都師范大學附屬回龍觀育新學校 北京 102208 3 北京市第五中學 北京 100007)

高中階段,選修生物學的學生在實驗上需要更多的學習和實踐,其中包括培養基的配制、無菌操作、微生物的培養和分離、微生物的計數、微生物的鑒定[1]等基礎實驗。在基因工程實驗學習中,還涉及限制酶切割DNA、DNA 的連接、大腸桿菌的轉化和篩選[2]等實驗操作。學生在學習中,很多實驗都是做完拋之腦后,甚至有些實驗仍處于紙上談兵階段。因此,在學習中保持知識的連貫性,并學以致用非常重要。文獻調查顯示,“藍白斑篩選實驗” 可有效地貫穿以上知識和實驗內容[3-4],以一個完整的大實驗形成科技實踐活動。通過實踐,可促進學生掌握知識,提高能力,提升科學素養。

1 實驗原理

細菌細胞吸收外源DNA 并發生可遺傳的改變,稱為轉化。通過Ca2+處理的化學方法誘導大腸桿菌進入感受態,有利于外源DNA 進入細菌內[3]。

β-半乳糖苷酶可使顯色底物X-Gal 分解為藍色,使菌落呈現藍色;若有外源DNA 片段插入至載體中,則β-半乳糖苷酶基因失活,從而產生白色菌落[3-4]。

2 實驗材料和儀器

2.1 材料:受體菌JM109(需在-80℃保存,或在干冰中短時間保存),pMD19-T 載體試劑盒、ITPG溶液、X-Gal、NaCl、瓊脂、酵母粉、蛋白胨、冰、燒杯、錐形瓶、玻璃棒、移液器、離心管、培養皿等。

2.2 儀器:恒溫培養箱、恒溫搖床、離心機、攪拌器、冰箱等。

3 實驗步驟

1)將ITPG 和X-Gal 配制為溶液,除菌后冷凍保存,備用。

2)制備LB 液體培養基、LB 固體培養基、含氨芐青霉素(標記為Amp+)的LB 固體培養基,備用。

3)重組質粒的制備:實驗組按照下表配制反應體系,使Insert DNA 與pMD19-T 載體(質粒)連接;對照組將表1 中的Control Insert 替換為等量蒸餾水,其他條件相同。

表1 pMD19-T 中插入Insert DNA 的反應體系

4)將質粒轉化至大腸桿菌:將實驗組和對照組的產物分別轉入感受態大腸桿菌中。①取出2管受體菌置于冰上融化;②冰上操作,將步驟3的反應產物分別與受體菌輕打混勻,冰上放置30 min;③熱激法轉化:將離心管放置于42℃水浴,熱激90 s,轉化中勿搖動離心管;④將離心管轉移至冰浴,放置1~2 min;⑤每管加400 μL LB 液體培養基,在37℃搖床緩慢搖動培養45 min,使細菌復蘇。

5)制備含ITPG、X-Gal 的培養基(現用現制):取適量ITPG、X-Gal 溶液均勻涂布于含有氨芐青霉素的LB 固體培養基表面,晾干。

6)涂板:取100 μL 步驟4 獲得的轉化細菌分別涂布于添加IPTG、X-Gal 的培養基表面,37℃恒溫培養箱倒置培養12 h。

7)觀察:實驗組和對照組經轉化后的大腸桿菌菌落呈現出不同的顏色,若顯色不明顯,可將平板置于4℃培養2~4 h 后再觀察,分別統計實驗組、對照組中的藍斑和白斑數目。

4 結果與討論

按照以上步驟完成藍白斑篩選實驗后,需進一步根據菌落的顏色和數目計算重組效率,實驗結果如圖1(本文附圖見封四)所示。在實驗組里,外源DNA 與T 載體連接成功的會破壞β-半乳糖苷酶基因的表達,理論上應都應呈現白斑,但實際結果是仍有少量藍斑存在,推測其原因可能是T載體發生自連。但是,重組效率為93%可表明,重組比較成功。對照組只加入了T 載體,理論上不會產生白斑,然而實際上仍有白斑出現,因此,推測T 載體發生自連時,其末端的部分脫氧核苷酸脫落,使連接后的閱讀區發生改變,從而改變mRNA 的序列,導致蛋白質結構變化,最終引起性狀差異。

5 小結

通過藍白斑篩選實驗,培養基的配制、滅菌、無菌操作、DNA 的連接、菌落的計數等不再是孤立的實驗步驟,而是服務于一個大的實驗目的“通過外源基因的導入,使大腸桿菌發生轉化,最終產生白色的菌落”。在“藍白斑篩選”科技實踐活動中,知識學習更加系統化、能力提升更加全面化,實驗結果的分析和討論還能提高學生的思辨能力,從而全方位提升學生的學科素養和綜合素養。

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