乳清蛋白變性率測定方法研究進(jìn)展

邵曉園，李高聰，盧興，彭麗，佟貴山，張軍

（1.黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心哈爾濱150500；2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院黑龍江省普通高校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室哈爾濱150080；3.雙城市君宇奶牛養(yǎng)殖有限公司哈爾濱150131）

0 引 言

乳清蛋白的變性會對乳制品產(chǎn)品品質(zhì)產(chǎn)生重要的影響。生產(chǎn)酸奶時，殺菌處理會導(dǎo)致部分乳清蛋白變性，改變酸奶的硬度、黏度和組織狀態(tài)，還可通過防止乳清析出，從而改善酸奶的品質(zhì)，與酸奶的質(zhì)量具有顯著的相關(guān)性[3-5]。在消毒奶生產(chǎn)過程中，乳清蛋白變性會使一些營養(yǎng)成分損失，如免疫球蛋白免疫活性喪失、過氧化物酶活性喪失，降低了蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值[6]。生產(chǎn)干酪時，熱處理溫度升高，乳清蛋白變性率增加，一方面會提高奶酪產(chǎn)量，另一方面也會提高奶酪的營養(yǎng)價值[7]。乳清蛋白變性程度會嚴(yán)重影響乳制品中營養(yǎng)成分的生物利用，從而影響乳制品的品質(zhì)。因此，完善乳清蛋白變性率測定方法是極為重要和必要的，對提高我國乳品質(zhì)量具有非常重要的意義。

1 乳清蛋白變性的機(jī)理

乳清蛋白變性是指蛋白質(zhì)特有的二級、三級結(jié)構(gòu)的變化，是原來多肽鏈因外界因素疏松或打開，其一級結(jié)構(gòu)中共價鍵連接的肽鏈完好，并未發(fā)生斷裂[8]。蛋白質(zhì)變性過程包括兩個階段：第一，當(dāng)外界溫度達(dá)到60 ℃時，原本多肽鏈的折疊結(jié)構(gòu)疏松或打開，導(dǎo)致變性反應(yīng)發(fā)生；第二，多肽鏈打開后變得越發(fā)活躍，容易與其他乳清蛋白或者是酪蛋白膠粒結(jié)合[9]。例如：β-Lg 在發(fā)生變性時，隨著其三級結(jié)構(gòu)展開，使得-SH暴露在外。由四個二硫鍵連接的α-la 在發(fā)生變性時，Cys6-Cysl20 之間的二硫鍵最先被破壞[10]。熱處理是使乳清蛋白發(fā)生變性的重要因素，此外pH 值、離子強(qiáng)度、基質(zhì)等也都會導(dǎo)致乳清蛋白變性[11]。

2 乳清蛋白變性率測定方法

乳清蛋白變性率測定的基本原理是測定變性前、后乳清蛋白質(zhì)含量差，通過含量差占變性前含量的百分比求得。可見，其可靠性及方便性完全取決于乳清蛋白質(zhì)的測定方法。

2.1 凱氏定氮法（國標(biāo)法）

凱氏定氮法的基本原理是：通過測定物質(zhì)中的氮含量來估算物質(zhì)的總蛋白質(zhì)含量。它于1833 年由丹

麥化學(xué)家凱道爾提出。目前國標(biāo)使用凱氏定氮法來測定乳清蛋白變性率，首先是將乳樣離心去除脂肪，再用1 mol/L 的HCl 離心去沉淀，所得的上清液（未變性的乳清蛋白溶液）加催化劑反應(yīng)、蒸餾，餾出液內(nèi)加硼酸后使用鹽酸滴定，根據(jù)消耗酸的量計算未變性乳清蛋白含量，利用原料乳與熱處理乳的乳清蛋白含量之差計算變性率[12]。計算公式如下：

凱氏定氮法整個實(shí)驗(yàn)需要的時間非常長、實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜、試劑消耗量大、只能測定樣品中的總蛋白質(zhì)，不能測定單一蛋白成分，不能進(jìn)行大批量樣品測定[13]。但是因其測定結(jié)果準(zhǔn)確，穩(wěn)定，可作為蛋白質(zhì)含量檢測的標(biāo)準(zhǔn)，用以驗(yàn)證其他檢測方法的準(zhǔn)確性。

2.2 色譜法

2.2.1 快速蛋白液相色譜法（FPLC）

1985 年Manji[14]提出了快速蛋白液相色譜法（Rapid Protein Liquid Chromatography，F(xiàn)PLC），用于測定乳清蛋白變性。其原理是：乳清蛋白中的每一種蛋白經(jīng)FPLC 分離后，在280 nm 處測定吸光度值（OD值），根據(jù)OD 值計算蛋白質(zhì)濃度，經(jīng)熱處理后未變性乳清蛋白濃度會發(fā)生變化，在熱處理后各種乳清蛋白標(biāo)準(zhǔn)峰面積（SPA）和原料乳中乳清蛋白的SPA 比較，就可得出乳清蛋白變性率。計算公式參照公式（1）。FPLC 法重復(fù)性好，且迅速方便，能定性定量測定每一種乳清蛋白的變性率，克服了凱氏定氮法僅能測定蛋白變性總量的缺點(diǎn)[15]。

2.2.2 反高效液相色譜法（RP-HPLC）

反高效液相色譜法（RP-High Performance Liquid Chromatography，RP-HPLC）可以對乳中未變性的乳清蛋白進(jìn)行分離并定量測定。基本方法為原料乳或加熱乳經(jīng)離心脫脂后，用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH 至4.6 沉淀酪蛋白和變性的乳清蛋白，經(jīng)離心或過濾除去沉淀后得到未變性乳清蛋白，再經(jīng)0.45 μm 尼龍膜過濾，即可上樣測定。乳清蛋白變性百分?jǐn)?shù)的計算和FPLC 法相同。王浩等人[16]使用RP-HPLC 對牛奶及其乳制品中7 種蛋白成分進(jìn)行分離，解決了乳制品加工后變性蛋白含量測定不準(zhǔn)確的問題。朱鑫鑫[17]等人用此方法來測定不同乳樣中未變性乳清蛋白含量，結(jié)果表明此方法能將4 種乳清蛋白分離并且定量準(zhǔn)確，適合應(yīng)用于乳清蛋白的定量和定性。 RP-HPLC 與凱氏定氮法相比較準(zhǔn)確、快速，但所需標(biāo)準(zhǔn)品和儀器價格昂貴，檢測成本較高。

2.3 分光光度法

2.3.1 雙縮脲法

雙縮脲法的原理是：脲在180 ℃時脫氨生成雙縮脲，與Cu2+形成紫紅色復(fù)合物，顏色深淺與蛋白含量在一定范圍內(nèi)成正相關(guān)，對乳清蛋白樣品的吸光度值進(jìn)行檢測，與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對比便可找出蛋白質(zhì)的濃度[18]。在檢測原料乳和熱處理乳的乳清蛋白含量的基礎(chǔ)上，通過差量法得到變性的乳清蛋白量，從而得到乳清蛋白變性率。路純明[19]等人采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了雙縮脲法的測定條件，進(jìn)而測定酸奶、牛奶中蛋白質(zhì)含量，結(jié)果表明該方法測定結(jié)果準(zhǔn)確，且與凱氏定氮法的相對誤差僅為3%。王振華[20]等人在雙縮脲法的基礎(chǔ)上添加過濾步驟，對牛乳中未變性乳清蛋白進(jìn)行測定，結(jié)果表明該方法精確度、準(zhǔn)確度、回收率等均較高。雙縮脲法測試時間短，過程操作簡單，可大批量測定，但同時也存在準(zhǔn)確度、靈敏度較差，測定蛋白質(zhì)范圍只有1～20 mg 等缺點(diǎn)[21]。

2.3.2 考馬斯亮藍(lán)法

考馬斯亮藍(lán)法的基本原理是：考馬斯亮藍(lán)（G-250）溶液與乳清蛋白反應(yīng)生成藍(lán)色復(fù)合物，測定乳樣品在595 nm 處的OD 值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對比便可找出蛋白質(zhì)的濃度[22]。1976 年Bradford[23]首次提出了使用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量，在檢測原料乳和熱處理乳的乳清蛋白含量的基礎(chǔ)上，通過差量法得到變性的乳清蛋白量，從而得到乳清蛋白變性率。聶昌宏[24]等用此方法對牛乳中未變性乳清蛋白和總蛋白含量進(jìn)行了測定，結(jié)果表明在0.005～0.1 mg/mL 范圍內(nèi)的OD 值線性關(guān)系（r=0.9995）良好，RSD 為2.03%，驗(yàn)證了該方法可以對未變性乳清蛋白和總蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確測定。考馬斯亮藍(lán)法靈敏度高，檢測下限達(dá)1 ug 左右，測定過程需要的時間短，操作簡便，而且穩(wěn)定性比較好。

2.3.3 Lowry法

1921 年Folin 創(chuàng)造了Folin－酚試劑法來測定蛋白質(zhì)，但該法靈敏度低[25]。1951 年，Lowry 改進(jìn)Folin 法，發(fā)現(xiàn)在堿性環(huán)境下，肽鍵與Cu2+形成的螯合物與Folin試劑可產(chǎn)生藍(lán)色混合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量正相關(guān)[26-27]，通過測得的O.D 值計算含量。Lowry 法具有操作簡單、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是受多種因素干擾，需要購買試劑盒，需要的資金多，不適應(yīng)于大批量樣品測定[28]。

2.3.4 二喹啉甲酸法（BCA）

二喹啉甲酸法的基本原理是：蛋白質(zhì)與BCA 試劑可生成有色化合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，在562 nm 下測定其吸光度值，根據(jù)試樣的吸光度值在對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出對應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度[29]。在檢測原料乳和熱處理乳的乳清蛋白含量的基礎(chǔ)上，通過差量法得到變性的乳清蛋白量，從而得到乳清蛋白變性率。BCA 法的抗干擾能力明顯強(qiáng)于凱氏定氮法，靈敏度高，檢測下限達(dá)0.5 ug[1，30]。此外，BCA 法具有速度快、結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡單、所用試劑較少、分析成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。

2.4 其他方法

2.4.1 差示掃描量熱法（DSC）

許多研究者應(yīng)用差示掃描量熱法（DSC）研究了乳清蛋白的變性問題[15]。蛋白質(zhì)的變性焓變通過公式△H=4RTD2-△TD1/2來計算，式中：TD為變性溫度，是熱吸收峰的半峰寬，R 是氣體常數(shù)，據(jù)此我們可以求得蛋白變性率（%），即：

在測定蛋白質(zhì)濃度為2%～7%的溶液時，此方法存在重復(fù)性差，定量困難的缺點(diǎn)，不適用于在乳品中進(jìn)行乳清蛋白變性的定量測定。但蛋白質(zhì)濃度高于10%時，DSC 方法不僅能夠得到較為準(zhǔn)確的變性溫度，而且能得到變性百分比結(jié)果[15]。

2.4.2 乳清蛋白氮指數(shù)法（WPNI）

乳清蛋白氮指數(shù)法（Whey Protein N Index，WPNI）的原理是：通過對濁度（420 nm 下乳清上清液的透明度）的迅速測定，與對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對比，再通過計算得到WPNI 值，比較原料乳和熱處理乳的WPNI 值得到乳清蛋白的變性率。由1947 年Harland首次提出并經(jīng)Leighton 等修正后應(yīng)用于乳清蛋白變性的測定中。王婷婷[31]等人采用在蛋白質(zhì)溶液中加鹽酸導(dǎo)致溶液混濁，利用420 nm 處的吸光度值表征變性程度，結(jié)果表明該方法具有測定迅速、方便的優(yōu)點(diǎn)，但是與凱氏定氮法比較，重復(fù)性差誤差稍大，不適用于對乳清蛋白變性進(jìn)行精確測定[32]。

2.4.3 SDS電泳法

SDS 電泳法的基本原理是：十二烷基硫酸鈉（SDS）可破壞蛋白質(zhì)的非共價鍵，使蛋白質(zhì)變性[19]。乳清蛋白變性后分子量會發(fā)生較大變化，電遷移率也會隨之發(fā)生較大變化，再通過電泳和光密度掃描，對照原料乳和熱處理乳計算乳清蛋白變性率。它由Shapiro[33]于1967 年建立，可用于分離各種蛋白質(zhì)和核苷酸[34-35]。SDS 電泳法不能對免疫球蛋白進(jìn)行定性定量測量，因而對總蛋白的測定結(jié)果產(chǎn)生影響，另外對儀器設(shè)備要求較高，結(jié)果需用Bandscan 軟件后處理，誤差較大，測定所需時間長[36]。

2.5 方法整理對比

以上對常見乳清蛋白測定方法進(jìn)行了詳細(xì)介紹，各方法均有其自身特點(diǎn)，現(xiàn)將其優(yōu)缺點(diǎn)做出整理，如表1所示。

表1 乳清蛋白測定方法比較

3 展 望

乳清蛋白變性率是乳制品加工過程中品質(zhì)控制的一項(xiàng)關(guān)鍵指標(biāo)，其測定方法有很多種，凱氏定氮法作為經(jīng)典方法，測定結(jié)果準(zhǔn)確，所以GB 5009.5-2010采用此方法，但操作復(fù)雜、耗時長，可作為基準(zhǔn)檢測使用；色譜法，由于可以分離各種蛋白質(zhì)并進(jìn)行定量，所以該法針對性更強(qiáng)，但成本很高。比較研究結(jié)果顯示，色譜法測定速度快，實(shí)用價值和應(yīng)用前景比較明朗，且RP-HPLC 法和FPLC 法都與凱氏定氮法結(jié)果有很好的一致性[37]。差示掃描量熱法、WPNI 法具有方便、快速的特性，但是測定結(jié)果精確度差，應(yīng)用上受到限制。分光光度法是通過測定樣品的吸光度值來計算變性率，操作相對簡單且測定時間短，但需要完成顯色反應(yīng)過程，所以顯色劑選擇成為關(guān)鍵，要求選擇性好、靈敏度高（ε＞104）、化學(xué)組成和性質(zhì)穩(wěn)定、顯色劑和產(chǎn)物有明顯的顏色差（Δl＞60nm）等條件，因此，對分光光度法的優(yōu)化及開發(fā)有廣闊的發(fā)展空間，是今后蛋白質(zhì)測定方法研究的重要方向。