基于16S rRNA的肝郁血虛型失眠患者口腔微生態(tài)與中醫(yī)舌象的相關(guān)性研究

劉 夢(mèng)，王曦廷，李 峰，譚麗博，李 杰，關(guān) 靜

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京，100029）

失眠癥是世界范圍內(nèi)的慢性疾病[1-2]。研究表明，失眠證的相關(guān)發(fā)病機(jī)制與中樞神經(jīng)系統(tǒng)γ-氨基丁酸（GABA）能等神經(jīng)遞質(zhì)關(guān)系密切[3-4]。近年來，有關(guān)腸-菌群-腦軸的研究逐漸受到關(guān)注[5-7]，它揭示了腸道微生態(tài)、藥物經(jīng)腸道代謝及大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)三者間存在的潛在對(duì)話機(jī)制[8]。研究表明，菌群與宿主免疫系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等調(diào)節(jié)機(jī)制關(guān)系較為密切，口腔菌群也與大腦內(nèi)病變（例如帕金森疾病）具有潛在的關(guān)聯(lián)[9-10]。

中醫(yī)認(rèn)為“心主神志”，心主神志的氣機(jī)功能失調(diào)，是失眠的主要原因。肝主氣機(jī)疏泄，與情緒、心理關(guān)系密切。故中醫(yī)治療失眠癥多從“心與肝”論治。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，社會(huì)關(guān)系及工作壓力等因素影響，肝郁血虛型失眠患者較為多見。肝郁血虛型失眠患者常表現(xiàn)為入睡困難、睡后不實(shí)、易受驚擾，且情緒常伴抑郁傾向，也表現(xiàn)出面蒼白、面色淡白或萎黃，唇舌爪甲色淡，頭暈眼花，心悸多夢(mèng)等血虛癥狀。臨床治療肝郁血虛型失眠患者，往往也將舌象作為辨證論治的重要依據(jù)。其中淡白舌者，紅色偏少而白色偏多，多提示氣血虧虛，血不榮舌，或陽氣虛衰，運(yùn)血無力；紫暗舌者為氣血運(yùn)行不暢的病理改變。

本研究基于課題基金“失眠癥常見證候的舌面菌群特征及與舌象相關(guān)性的研究”的支持，從肝郁血虛型失眠患者中篩選出具有典型淡白舌舌象與紫暗舌舌象受試者，收集其口腔菌群樣本，采用16S rRNA 的技術(shù)檢測(cè)。通過生物信息學(xué)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，探究肝郁血虛型失眠患者中淡白舌與紫暗舌在口腔菌群生物多樣性和物種構(gòu)成上的差異，以期為揭示導(dǎo)致舌象差異的潛在口腔微生態(tài)機(jī)理提供思路。

1 材料與方法

1.1 病例篩選

1.1.1 失眠癥及證型診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照由中華醫(yī)學(xué)會(huì)精神科分會(huì)制定的《中國(guó)精神障礙分類與診斷標(biāo)準(zhǔn)CCMD-3》[11]中非器質(zhì)性失眠癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入患者應(yīng)滿足如下失眠特征：①幾乎以失眠為唯一的癥狀，包括難以入睡、睡眠不深、多夢(mèng)、早醒、或醒后不易再睡、醒后不適感、疲乏，或白天困倦等；②具有失眠和極度關(guān)注失眠結(jié)果的優(yōu)勢(shì)觀念；③對(duì)睡眠數(shù)量、質(zhì)量的不滿引起明顯的苦惱或社會(huì)功能受損；④至少每周發(fā)生3次，并至少已1個(gè)月。

中醫(yī)肝郁血虛型診斷標(biāo)準(zhǔn)參照：①主證：失眠，抑郁易怒，神疲乏力；②次證：面色少華，眩暈耳鳴，胸脅脹痛，食少納呆，大便結(jié)；舌質(zhì)紅，舌苔白或微黃，脈弦細(xì)或弦細(xì)數(shù)。主證必須具備,并兼有次證1 項(xiàng)以上，結(jié)合相應(yīng)舌脈即可診斷。

1.1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)

本實(shí)驗(yàn)患者招募于北京市國(guó)醫(yī)堂中醫(yī)門診部。對(duì)受試者設(shè)定如下納入標(biāo)準(zhǔn)，需符合下列中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：①患者匹茲堡睡眠指數(shù)（PSQI）總得分≥8分；②受試者年齡范圍為18-65 周歲；③實(shí)驗(yàn)患者自愿參加本觀察且征求患者知情同意。同時(shí)，對(duì)于所招募患者，如出現(xiàn)如下情況者予以排除：①有口腔疾病或口腔衛(wèi)生問題；②有慢性胃腸道疾病的患者；③精神障礙或器質(zhì)性疾病癥狀所引起的失眠患者；④孕婦及哺乳期婦女；⑤藥物或酒精引起的失眠患者；⑥合并有嚴(yán)重全身性疾病者。

1.1.3 病例資料收集

采集受試者口腔菌群時(shí)間統(tǒng)一為清晨8 點(diǎn)，所有受試者于采集口腔菌群前20 min 進(jìn)行純凈水漱口。采集者使用一次性DNA 采集包（粵深械備20160060）進(jìn)行口腔菌群的收集，使用方法為采集者手持一次性無菌拭子各旋轉(zhuǎn)刮拭臉頰內(nèi)側(cè)20次，盡量避免接觸牙齒和舌頭，隨后將拭子放入采樣管樣液中，每位受試者均收集2個(gè)樣本以備用，隨后立即放入-80℃冰箱進(jìn)行樣本凍存。

1.2 PCR實(shí)驗(yàn)及質(zhì)控

首先，對(duì)各樣本進(jìn)行基因組DNA 的抽取。針對(duì)V3 與V4 測(cè)序區(qū)域合成帶有條碼的引物，或者合成帶有錯(cuò)位堿基的融合引物。將同一樣本的PCR 產(chǎn)物混合，并用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。通過盡可能使用低循環(huán)數(shù)擴(kuò)增，并且保證每個(gè)樣本擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)一致的方式保證后續(xù)數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性及可靠性。最后，采用隨機(jī)方法選取具有代表性的樣本來進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確保在最低循環(huán)數(shù)中使絕大多數(shù)樣本能夠擴(kuò)增出濃度合適的產(chǎn)物。隨后，構(gòu)建Miseq 文件庫，并進(jìn)行Miseq 上機(jī)測(cè)序。進(jìn)行格式規(guī)范處理、數(shù)據(jù)去雜、有效數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、優(yōu)勢(shì)序列分布。將下機(jī)后原始數(shù)據(jù)結(jié)果以FASTQ 格式存儲(chǔ)。隨后對(duì)FASTQ 數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾處理。過濾read尾部質(zhì)量值20以下的堿基，其中融合的利用軟件Trimmomatic，barcode的利用軟件Pear。

1.3 生物信息學(xué)與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Qiime[12]進(jìn)行OTU 聚類。通過聚類操作可以使序列按照相似性歸為許多小單元。設(shè)置0.97 相似度閾值對(duì)所有序列的OTU 單元進(jìn)行聚類。選擇16 s細(xì)菌和古菌核糖體數(shù)據(jù)庫，選擇silva128 Silva，采用RDP Classifier 算法，置信度閾值為0.7，得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息，并在界（kingdom）、門（phylum）、綱（class）、目（order）、科（family）、屬（genus）、種（species）各個(gè)水平注釋其群落的物種信息。對(duì)所有樣本按照分組樣本的方式進(jìn)行生物多樣性分析。微生物組學(xué)中α多樣性主要反映微生物群落的豐度和多樣性，一般用Chao1 指數(shù)（菌種豐富度指數(shù)）、Shannon（值越大，說明群落多樣性越高）；β多樣性分析可以進(jìn)行進(jìn)一步的樣本間生物多樣性差異性對(duì)比。統(tǒng)計(jì)分析使用R語言完成。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

圖1 生物多樣性曲線。

對(duì)所有樣本進(jìn)行稀釋性曲線（Rarefaction curve)、Shannon-Wiener 曲 線、Rank-Abundance 曲 線、Specaccum 物種累積曲線分析，以對(duì)比測(cè)序數(shù)據(jù)量不同的樣本里物種豐度和說明測(cè)序樣本的數(shù)據(jù)量是否合理。結(jié)果如圖1-A 所示，隨著樣本測(cè)序量的增加，受試者樣本的OTU 數(shù)量遞增；各樣本在深度增加至15 000 后OTU 數(shù)增加量趨于平緩，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理。Shannon-Wiener 分析結(jié)果見圖1-B，Shannon 指數(shù)在經(jīng)過快速增長(zhǎng)后表現(xiàn)趨于平緩，表明樣本的測(cè)序結(jié)果可以反映絕大多數(shù)的微生物信息，樣本的測(cè)序質(zhì)量有效。Rank-abundance 曲線見圖1-C，水平方向?qū)挾容^寬，曲線較為平滑，表明本研究中收拾者樣本的物種豐度及均勻度較好。物種累積曲線結(jié)果見圖1-D，受試者樣本在持續(xù)抽樣過程中，曲線區(qū)域平緩，表明樣本抽樣充分，不需增加新樣本，可以進(jìn)行下一步數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2.2 OTU聚類注釋分析

為了使OTU 單元聚類結(jié)果可靠，本研究將測(cè)序深度穩(wěn)定在15 969 tag，共產(chǎn)生2 195個(gè)OTU，其中單樣本最小OTU 單元數(shù)量值為152，最大OTU 單元數(shù)量值為872。隨后進(jìn)行OTU 基礎(chǔ)分析，對(duì)肝郁血虛型失眠患者中醫(yī)舌象亞組繪制韋恩圖。韋恩圖表明，肝郁型失眠患者組（圖2-A 中a 圈）獨(dú)有577 個(gè)OTU 單元；血虛型失眠患者組（圖2-A 中b 圈）獨(dú)有468 個(gè)OTU 單元，兩組共有1150個(gè)OTU單元。

為了進(jìn)一步探究樣本中普遍存在哪些OTU，即尋找出核心OTU，本研究通過Qiime 平臺(tái)對(duì)所有樣本的OTU 進(jìn)行了核心微生物（Core microbiome）分析，結(jié)果見圖2-B。在隨著參與樣本的擴(kuò)增，核心物種值隨之下降，一直到樣本擴(kuò)增到所有樣本（即x 軸坐標(biāo)為1.0）時(shí)，共有OTU 的最終為鏈球菌、奈瑟菌屬、梭桿菌屬等17種。

2.3 物種組成及生物多樣性分析

進(jìn)一步分析各組物種組成的成分以及兩組樣本間物種組成的差異。分別從門水平和屬水平比較兩組的優(yōu)勢(shì)物種分布。結(jié)果表明，所有樣本主要由15個(gè)菌門中的245 個(gè)菌屬構(gòu)成，其中10 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門為：厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、TM7、綠彎菌門、藍(lán)細(xì)菌門、芽單胞菌門、酸桿菌門、螺旋體門。門水平上，5 種優(yōu)勢(shì)菌門相對(duì)豐度共96.48%：厚壁菌門（相對(duì)豐度：43.13%，下同）、變形菌門（20.60%）、放線菌門（11.07%）、擬桿菌門（13.78%）、梭桿菌門（7.9%）。屬水平上，7 種優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)豐度共68.32%：鏈球菌（31.14%）、奈瑟菌（10.21%）、羅斯氏菌（7.62%）、梭桿菌（4.06%）嗜血桿菌（3.73%）。

圖2 A肝郁型失眠患者組（a）與血虛型失眠患者組（b）OTU韋恩圖；B所有樣本核心微生物

圖3 肝郁型失眠患者組與血虛型失眠患者組口腔微生物菌群構(gòu)成（門與屬水平）

對(duì)于淡白舌組，門水平上優(yōu)勢(shì)菌群為厚壁菌門（44.28%）、變形菌門（26.93%）、放線菌門（12.62%）、擬桿菌門（8.42%）、梭桿菌門（6.04%），見圖3-A；屬水平上，優(yōu)勢(shì)菌群為鏈球菌屬（32.43%）、奈瑟菌屬（14.11%）、羅氏菌屬（9.36%）、嗜血桿菌屬（5.12%）、普雷沃菌屬（4.28%），見圖3-B。對(duì)于紫暗舌組，門水平上優(yōu)勢(shì)菌群為厚壁菌門（41.97%）、擬桿菌門（19.14%）、變形菌門（14.27%）、梭桿菌門（9.80%）、放線菌門（9.51%），見圖3-C；屬水平上優(yōu)勢(shì)菌屬為鏈球菌屬（29.87%）、普雷沃菌屬（11.13%）、奈瑟菌屬（6.32%）、羅氏菌屬（5.89%）、梭桿菌屬（5.67%），見圖3-D。

隨后，使用Wilcoxon 檢驗(yàn)，對(duì)淡白舌組與紫暗舌組進(jìn)行差異菌群統(tǒng)計(jì)分析。門水平上，物種豐度大于1%的差異菌門有：變形菌門、擬桿菌門、梭桿菌門（圖4-A、B）。屬水平上，物種豐度大于1%的差異菌屬有：奈瑟菌屬、羅氏菌屬、普雷沃菌屬、梭桿菌屬、卟啉單胞菌屬、韋榮球菌屬（圖4-C、D）。

對(duì)兩組樣本進(jìn)行α多樣性分析，結(jié)果見圖5。由圖可以看出，淡白舌組口腔菌群的α多樣性指數(shù)略大于紫暗舌組，差異具有顯著性。進(jìn)一步進(jìn)行β生物多樣性分析。PCA 降維表明，紫暗舌組樣本可形成聚落，而淡白舌組樣本相對(duì)分散，兩組樣本的分布可以找到較為明顯的區(qū)分線。

圖4 肝郁血虛型失眠患者淡紫暗舌組（E）與白舌組（F）差異菌群對(duì)比（Wilcoxon，P ＜0.05）

使用Anosim 方法進(jìn)行兩兩組比較分析，見圖6-C，結(jié)果為紫暗舌組與淡白舌組相比，R值為0.169，p值為0.006。R值大于0表明兩組樣本組間差異大于組內(nèi)差異，p值＜0.05 表明紫暗舌組與淡白舌組的組間差異具有顯著性。隨后，通過LDA Effect Size 分析觀察兩組中具有顯著性差異的菌群構(gòu)成，結(jié)果見圖6-A。結(jié)果表明，紫暗舌組在羅斯氏菌屬、微球菌科（Micrococcaceae）、奈瑟菌目（Neisseriales）、奈瑟菌科（Neisseriaceae）、奈瑟菌（Neisseria）、微黃奈瑟球菌（Neisseria_subflava）、變形菌門（Proteobacteria）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria）的LDA score顯著高于淡白舌組；而淡白舌在擬桿菌門、擬桿菌綱（Bacteroidia）、擬桿菌目（Bacteroidales）、普氏菌科（Prevoltelaceae）、普氏菌屬（Prevoltela）、產(chǎn)黑普氏菌（Prevoltela）、梭桿菌門 、梭 桿 菌 綱（Fusobacteriia）、梭 桿 菌 目（Fusobacteriales）、梭桿菌科（Fusobacteriaceae）、梭桿菌屬、卟啉單胞菌科（Porphyromonadaceae）的LDA 值明顯高于紫暗舌組。隨后從系統(tǒng)進(jìn)化的角度比較兩組差異物種（見圖6-B），紫暗舌組和淡白舌組的差異菌群在系統(tǒng)進(jìn)化角度具有較大的特異性。

圖5 紫暗舌組（E）與淡白舌組（F）的α多樣性指數(shù)及PCA、PCoA降維分析

通過網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)一步分析紫暗舌組與淡白舌組優(yōu)勢(shì)物種的相關(guān)性情況。通過Spearman 相關(guān)性分析，將相關(guān)系數(shù)大于0.6 且p值小于0.05 的數(shù)據(jù)輸入Cytoscape 軟件，以完成結(jié)果的可視化展示（見圖6-D）。網(wǎng)絡(luò)圖主要擬合了5 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌群，分別是放線菌門、變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、梭桿菌門。整個(gè)網(wǎng)絡(luò)以正相關(guān)關(guān)系為主，厚壁菌門的OTU 單元占主導(dǎo)。放線菌門OTU_102（擬桿菌屬）與OTU_1238（厚壁菌屬）、OTU_1575（梭桿菌門屬）的共現(xiàn)性指數(shù)較高；OTU_1323（梭桿菌屬）OTU_738（變形菌屬）共現(xiàn)性指數(shù)較高，表明這些微生物具有較強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系。而擬桿菌門OTU_730（變形菌屬）與放線菌門OTU_1364（羅氏菌屬）及OTU_42（奈瑟菌屬）、OTU_548（鏈球菌屬）呈現(xiàn)出較弱的負(fù)相關(guān)關(guān)系。

3 討論

中醫(yī)舌象作為中醫(yī)舌診的重要組成部分，是反映人體臟腑氣血的重要指征，也是中醫(yī)辨證論治的重要過程。中醫(yī)認(rèn)為心開竅于舌，舌象與失眠的不同證候類型聯(lián)系密切。研究表明[13]，淡白舌的形成與紅細(xì)胞數(shù)減少、蛋白缺失、組織水腫、舌面微循環(huán)充盈不足等有關(guān)；紫暗舌則往往提示體內(nèi)血液流變學(xué)的改變,其形成機(jī)制與血氧飽和度下降、靜脈瘀血、血流緩慢、血小板凝聚性升高等有關(guān)。

從門分類水平來看，兩組樣本的優(yōu)勢(shì)微生物為厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、梭桿菌門；從屬分類水平來看，兩組樣本的優(yōu)勢(shì)微生物為鏈球菌屬、奈瑟菌屬、羅氏菌屬、普雷沃菌屬、纖毛菌屬。研究表明[14]，人類腸道菌群以厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門為主，其中擬桿菌、雙歧桿菌、梭菌、消化鏈球菌屬和奇異菌屬等厭氧菌為優(yōu)勢(shì)物種。由此可知，口腔中優(yōu)勢(shì)物種與腸道菌群具有相似性。物種組成分析表明，從門分類水平來看，兩組在厚壁菌門豐度最高，但差異不大，而在變形菌門、擬桿菌門及梭桿菌門差異較大。厚壁菌門的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)豐度可以看出本研究測(cè)序結(jié)果符合菌群的分布規(guī)律。有研究表明，肥胖者腸道菌群中擬桿菌門、厚壁菌門的比例較之體質(zhì)量正常者明顯降低。梭桿菌屬常見于消化道，是口腔中常見的共生菌，在口腔生物膜中起整合作用，可介由多種黏附素橋接生物膜中的微生物。變形菌門種類繁多，它是人體腸道菌群失調(diào)的微生物標(biāo)志，微生態(tài)失調(diào)產(chǎn)生過程有可能干擾微生物群落的穩(wěn)定性，變形菌門適應(yīng)性會(huì)隨之增強(qiáng)成為優(yōu)勢(shì)菌[15]。由此可知，舌淡白與舌紫暗與失眠患者口腔微生態(tài)失調(diào)相互反映，是機(jī)體出現(xiàn)疾病的標(biāo)志物信號(hào)。

圖6 A：紫暗舌組與淡白舌組LDA Effect Size分析

生物多樣性分析結(jié)果表明，淡白舌組口腔菌群的α多樣性指數(shù)略高于紫暗舌組，且差異具有顯著性（p＜0.05）。PCA 降維表明，紫暗舌組樣本可形成聚落，而淡白舌組樣本相對(duì)分散，兩組樣本的分布可以找到明顯的區(qū)分線。Anosim 分析表明兩組樣本組間差異大于組內(nèi)差異，且具有顯著性。紫暗舌組在羅斯氏菌屬、微球菌科、奈瑟菌目、奈瑟菌科、奈瑟菌（Neisseria）、微黃奈瑟球菌、變形菌門、β-變形菌綱的LDA score 顯著高于淡白舌組；而淡白舌在擬桿菌門、擬桿菌綱、擬桿菌目、普氏菌科、普氏菌屬、產(chǎn)黑普氏菌、梭桿菌門、梭桿菌綱、梭桿菌目、梭桿菌科、梭桿菌屬、卟啉單胞菌科的LDA 值明顯高于紫暗舌組。盡管舌苔形成是多因素作用的結(jié)果[16]，但兩組對(duì)比顯著的生物多樣性及菌群結(jié)構(gòu)差異或許是導(dǎo)致舌象變化的重要原因。

中醫(yī)舌象具有非常悠久的歷史，中醫(yī)舌象的客觀化也是當(dāng)前中醫(yī)舌診研究中的重點(diǎn)。本研究對(duì)肝郁血虛型失眠患者中的淡白舌與紫暗舌兩種典型舌像進(jìn)行口腔菌群對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)了兩種中醫(yī)舌象患者口腔微生態(tài)的生物多樣性及菌群結(jié)構(gòu)存在著顯著性的差異。這為進(jìn)一步揭示中醫(yī)舌象與疾病的相關(guān)性提供了新的方法和思路，為進(jìn)一步挖掘口腔微生態(tài)與中醫(yī)舌象的關(guān)聯(lián)性和生物標(biāo)志物，并應(yīng)用于臨床的診斷與療效預(yù)期判斷提供研究借鑒。