三七醇提物對秀麗隱桿線蟲的降脂作用＊

黃 壯，李 靜，杜鴻志，韓林濤，洪 怡，黃必勝，曹 艷

（湖北中醫藥大學藥學院 省部共建中藥資源和中藥復方教育部重點實驗室 武漢 430065）

三七[Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen]為五加科多年生草本植物，是我國傳統名貴的中藥材，藥用部分主要為根莖，至今已有六百多年的用藥歷史。三七，味甘、微苦、性溫，具有化瘀止血，活血定痛的功效。主治出血證，跌打損傷，瘀血腫痛。歸肝經、胃經、心經、肺經、大腸經[1]。現代藥理研究表明，三七具有活血止血、免疫調節、延緩衰老、改善記憶、促進生長發育、抗疲勞、降血脂等多種藥理活性[2-4]。據報道臨床使用中，三七單味藥使用或與其他中藥配伍使用，均表現出一定的降脂作用[5-6]。據動物實驗及臨床觀察結果表明，三七有較為明確的降脂效果，但涉及其降脂作用機制的研究尚未見報道。

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，簡稱C.elegans）屬于線性動物門線蟲綱，是一種全身透明，以細菌為食，廣泛自由生活在土壤里的無脊椎動物。秀麗線蟲體型小，生命周期短，后代繁殖量大，線蟲可進行同步化處理，保持一致性，提高可比性；秀麗線蟲是一個完整的生命體，有著簡單但完善的神經系統、生殖系統，與人類基因有較高的同源性[7]。秀麗線蟲的消化道由咽和腸兩部分組成，是脂類物質沉積的主要場所，由于線蟲蟲體透明，在顯微鏡下可以很清楚的觀察到從頭部到尾部的整個腸道狀況。因此，秀麗隱桿線蟲作為研究脂肪代謝與分子機制的重要模型，符合動物實驗3R 原則[8]，有著其他模式生物不可比擬的優勢，目前秀麗隱桿線蟲作為模式生物已廣泛應用于脂質的代謝研究。線蟲表皮和腸上皮細胞中存在多種脂質合成和催化酶，線蟲主要在皮下和腸道細胞儲存脂肪，可與脂質親和性染料結合并被染色，如尼羅紅、油紅O 等染料，通過穿過線蟲透明體的染料積累強度而量化線蟲體內的脂肪[9]。其中，油紅O 為脂溶性染料，在脂肪內能高度溶解，進而著色，能較好的顯示腸道內的脂肪滴。

本研究以秀麗線蟲為模型，觀察三七醇提物對線蟲的壽命、運動行為、生殖等基本生命特征的影響；并采用油紅O 對腸道脂滴進行染色，采用甘油三酯試劑盒法測定線蟲體內的甘油三酯水平，以確定三七醇提物的降脂作用；采用RT-PCR 法檢測脂肪代謝相關的基因，以探討三七降脂的作用機制，為三七降脂產品開發提供參考。

1 試劑與儀器

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，野生型N2），大腸桿菌菌株（E.coliOP50），均由華中農業大學動科院胡敏教授惠贈。三七藥材購于湖北強康中藥飲片有限公司，瓊脂糖（西班牙BIOWEST 公司），胰蛋白胨（英國OXOID 公司），油紅O（上海源葉生物科技有限公司），絞股藍總皂苷膠囊（亞寶藥業集團股份有限公司），其他試劑均購于生工生物工程股份有限公司。

SPX-150B-Z 型生化培養箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠），IX-73P1F型熒光倒置顯微鏡（日本OLYMPUS），熒 光 定 量PCR 儀（Roche，LightCycler 480II）,體式顯微鏡（南京江南永新光學有限公司）。

2 方法

2.1 樣品制備

取適量三七經萬能粉碎機粉碎后，采用篩分法過100 目篩，得三七粉。將三七粉加入5 倍量75%乙醇浸泡1 h，40℃超聲提取4次，每次30 min，提取液合并，濃縮，真空干燥，得三七醇提物樣品，置于干燥器中備用[10]，臨用前用M9 緩沖液（適量Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、MgSO4配制而成）溶解至所需濃度，并用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。絞股藍總皂苷膠囊作為陽性對照藥，取10 粒（每粒含絞股藍總皂苷60 mg），去囊殼，將囊心物用70%乙醇50℃溫浸2 h，過濾，濾液回收乙醇至終體積為10 mL，4℃備用。

2.2 線蟲同步化

用M9 緩沖液將產卵期線蟲從固體培養基（簡稱NGM 板）洗下，靜置3 min，吸走部分上清，留1 mL，加線蟲裂解液1 mL，渦旋震蕩5-8 min，3000rpm，快速離心2 min，吸走上清，加M9 液洗3-4 遍。25℃，M9 中放置過夜，即同步至L1期。

2.3 壽命實驗

將同步化至L4 期的線蟲分別置于含不同濃度三七醇提物的NGM 板中，終濃度分別為0 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL，每板線蟲約50 條，在25℃恒溫培養箱中培養，此時壽命計為day 0，每2 天觀察并計數各組線蟲的死亡數，并將存活線蟲轉至新板繼續培養。線蟲死亡評判標準為：無移動、無吞咽動作，且用珀金絲針輕觸也無反應。

2.4 生殖實驗

將線蟲挑至空白板及各含藥板中，每板1條，每組10 板，每24 h 將線蟲轉入新的NGM 中，直至排卵期結束。所有含卵板均在25℃孵育48 h 后再計數，各板孵出的子代線蟲數目之和即該線蟲總子代數[11]。

2.5 抗逆性實驗

熱應激實驗：將線蟲挑至空白板及各含藥板中，于25℃培養，4 天后置于37℃培養，每小時觀察并計數各組線蟲的生存情況，至所有線蟲全部死亡，線蟲死亡評判標準同壽命實驗[12]。氧化應激實驗：將線蟲挑至空白板及各含藥板中，于25℃培養4天后，將線蟲挑至含終濃度40 mmol/L 過氧化氫（H2O2）的96 孔板中，每孔10 條，每小時觀察并計數各組線蟲的生存情況，至所有線蟲全部死亡，線蟲死亡評判標準同壽命實驗。

2.6 甘油三酯含量測定

將同步化至L4 期的線蟲分組給藥處理，每組約1000 條，4 d 后，分別用M9 緩沖液洗下，超聲破碎提取甘油三酯，按照甘油三酯檢測試劑盒說明書進行檢測。根據標準曲線計算所含甘油三脂總量。

2.7 油紅O染色

將同步化至L4期的線蟲給藥處理4 d后，用M9洗下，去上清，加入120 μL 多聚甲醛，混勻，置于4℃，20 min，再轉至-80℃，15 min，固定后于40℃水浴解凍1 min，短暫離心去上清，用M9 緩沖液洗3 次，再加入油紅O 染液120 μL，染色2 h，去上清，用M9 緩沖液洗3次，顯微鏡下觀察拍照[13]。

2.8 脂肪相關的基因mRNA 表達水平測試

將同步化至L4 期的線蟲給藥處理4 d 后，破碎蟲體,Trizol 法提取線蟲總RNA，測定總RNA 的濃度及純度后，在逆轉錄酶催化下合成cDNA，繼而進行acs-2 mRNA、pod-2 mRNA、fat-5 mRNA 的RT-PCR 含量測定[14-15]。所用的引物序列：acs-2 mRNA 上游引物：5'-AGTGAGACTTGACAGTTCCG-3' ，下 游 引 物：5'-CTTGTAAGAGAGGAATGGCTC-3'；Pod-2 mRNA 上游引物：5'-TATGCGATGCCTGATGACTG-3'，下游引物：5'-TGTCTCCCAAACTGAACATAGC-3'；Fat-5 mRNA

圖1 三七醇提物對秀麗線蟲壽命影響的生存曲線（A）和平均壽命（B）

上游引物：5'-TGAACTGGACCCGAGTATTGA-3'，下游引物：5'-ACAGCCGAACTTCTTGCACT-3'。擴增結束后計算擴增效率，采用2-ΔΔCT法計算相對基因表達。

2.9 統計學分析

實驗均重復3 次，用SPSS 21.0 軟件分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用ONEWAY ANOVA 方差分析；數據以均數±標準差（x±s）表示，P＜0.05或P＜0.01表示有統計學差異。

3 結果

3.1 壽命實驗

如圖1所示，各給藥組生存曲線均較對照組右移，表現出延長壽命的作用。與空白對照組相比，0.8 mg/mL組線蟲的平均壽命延長13.69%（P＜0.05），最大壽命值為20 天；1.6 mg/mL 組線蟲平均壽命顯著延長22.07%（P＜0.01），最大壽命值為22 天。且給藥組線蟲的壽命隨著給藥劑量增加而延緩，呈現出劑量依賴關系。

3.2 生殖實驗

通過對線蟲給藥后子代數的觀察，發現三七醇提物對線蟲子代總數無影響。如圖2 所示，各給藥組的子代總數目與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)，表明在0.8 mg/mL、1.6 mg/mL 劑量下，三七醇提物對線蟲生殖能力均無顯著性影響。

3.3 抗逆性實驗

圖2 三七醇提物對秀麗線蟲生殖能力的影響

為了分析三七醇提物對秀麗隱桿線蟲抗逆性的影響，分別開展了熱應激實驗和氧化應激實驗。與對照組相比，熱應激條件下，不同劑量的三七醇提物均能使線蟲生存曲線右移，增強線蟲的耐熱能力，結果見圖3。與對照組相比，三七醇提物0.8 mg/mL 劑量組線蟲平均壽命增加了25.30%（P＜0.05），1.6 mg/mL 劑量組線蟲平均壽命增加了40.05%（P＜0.01）。與對照組相比，氧化應激條件下，不同劑量的三七醇提物均能使線蟲生存曲線右移，增強線蟲的抗氧化能力，結果見圖4。與對照組比較，三七醇提物0.8 mg/mL 劑量組線蟲平均壽命增加25.77%（P＜0.05），1.6 mg/mL 劑量組線蟲平均壽命增加了35.88%（P＜0.01）。由此可知，三七可顯著增強線蟲對熱應激和氧化應激耐受能力，改善線蟲的抗逆性。

3.4 甘油三酯含量測定

與對照組相比，不同劑量的三七醇提物均能使線蟲體內甘油三酯含量下降，但僅高劑量給藥組有顯著性差異；陽性對照藥1.0 mg/mL 絞股藍總皂苷能顯著降低甘油三酯含量，結果見圖5。0.8 mg/mL 劑量組三七醇提物線蟲使甘油三酯含量下降4.1%（P＞0.05），1.6 mg/mL 劑量組線蟲使甘油三酯水平顯著下降了8.9%（P＜0.05）。

3.5 腸道脂肪含量分析

圖3 熱應激條件下三七對秀麗線蟲生存率的影響;

圖4 氧化應激條件下三七對秀麗線蟲生存率的影響

圖5 三七醇提物對秀麗線蟲總甘油三酯水平的影響

如圖6 A 所示，油紅O 將線蟲腸道脂肪染為紅色，顏色鮮艷并且容易觀察，染色效果良好。對圖片應用ImageJ 軟件進行灰度分析，以量化數據。研究結果表明，用三七醇提物處理的線蟲的脂肪沉積程度明顯低于對照線蟲。與對照組相比，陽性對照藥1.0 mg/mL絞股藍總皂苷處理的線蟲腸道脂質含量下降了59.41%（P＜0.05），用三七醇提物處理的線蟲在0.8 mg/mL 和1.6 mg/mL 劑量下的腸道脂質含量分別下降了21.20%和52.83%（P＜0.05）；高劑量組與陽性藥比較無顯著差異，表明兩者效果相當（P＞0.05）。

3.6 對秀麗線蟲脂肪代謝相關基因的影響

圖6 三七醇提物對線蟲體內脂質含量的影響

圖7 三七對秀麗線蟲體內的脂肪代謝相關基因表達水平的影響

為了初步探討三七降脂作用的分子機制，研究三七對秀麗線蟲脂肪代謝相關基因的影響，本研究檢測了脂肪代謝相關基因的表達，見圖7。與對照組相比，1.6 mg/mL 三七給藥組線蟲的pod-2、fat-5mRNA 表達水平分別下調了17.3%、35.1%、acs-2 mRNA 表達水平平均上調了11.4%（P＜0.05）。

4 討論

在前期研究中，本實驗通過不同劑量三七提取物的給藥觀察，發現三七提取物在2 mg/mL 以內是安全劑量[16]，故本實驗劑量設計兩個有效劑量，分別為0.8 mg/mL、1.6 mg/mL。

實驗劑量的三七提取物對線蟲的壽命有延長作用，而對產卵量沒有顯著影響，且能提高線蟲抗熱應激和抗氧化應激能力[17]，由此表明，三七是一種安全的、具有潛在開發價值的降脂藥物。

本研究發現，三七可降低甘油三酯的含量，且呈現一定的劑量依賴。并觀察了線蟲腸道脂滴被染色情況，采用油紅O 染色后，通過分析線蟲腸道脂肪紅光密度值變化，確定了三七醇提物能減少秀麗隱桿線蟲脂肪沉積。這表明三七具有顯著降低線蟲腸道脂肪累積的作用，且隨著三七濃度升高，線蟲腸道脂肪含量逐漸降低。

為了探討三七對秀麗線蟲降脂的作用機制，采用了RT-PCR 分析方法對脂肪代謝相關的基因pod-2、fat-5、acs-2 mRNA 的表達水平進行了檢測分析。機體內脂肪的調控是個復雜的過程，據報道基因acs-2是參與調節脂肪酸β-氧化的第一步；pod-2、fat-5 是參與脂肪合成的基因。acs-2 上調表示脂肪酸氧化增強，pod-2、fat-5 下調說明脂肪合成量減少[18]。由此可見，三七可通過對脂肪代謝相關基因的調節使秀麗線蟲脂肪合成減少，降解增多，從而使體內脂肪累積減少。

生物體體內的脂肪貯存與利用一般是保持著動態平衡，機體在復雜的轉錄、翻譯及后期加工上對脂肪代謝進行調控[18]。pod-2 編碼乙酰輔酶A羧化酶（Acetyl CoA carboxylase)，催化 乙酰輔 酶A（Acetyl CoA）變成丙二酰輔酶A（Malonyl CoA）是脂肪合成第一步。該類酶也是脂肪酸從頭合成的限速酶；acs-2參與調節脂肪酸β-氧化的第一步；fasn-1、fat-5 是與脂肪合成有關的基因。三七醇提取能上調acs-2，下調fat-5、pod-2，故從基因表達水平可推斷三七使線蟲體內脂肪累積減少。脂肪代謝在機體生理和病理過程中都發揮著非常重要的作用，對長期的能量儲存、細胞內及細胞間信號傳導和維持細胞膜穩態都有重要的影響。過多的以甘油三酯（TAGs）形式的脂肪儲存，將伴隨著動脈粥樣硬化和二型糖尿病等疾病的發生，而適度的脂肪儲存則能延長壽命[19-20]，因此，保持脂肪代謝穩態對健康尤為重要。三七一方面表現出降低體內甘油三酯水平和減少腸道脂肪累積的作用，同時具有延長秀麗隱桿線蟲壽命、增強抗逆性的作用，由此可推斷，三七不僅有降低脂肪沉積的作用，還可能對機體脂肪代謝穩態具有較好的調節作用。

據前期文獻報道，三七總皂苷對非酒精性脂肪肝（NAFLD）大鼠表現出一定的降脂作用，其降脂作用機制跟其能夠降低肝臟中一氧化氮合酶（iNOS）和一氧化氮（NO）含量有關[3]。三七多糖對秀麗隱桿線蟲具有延長壽命的作用[21]。但也有學者報道，三七總皂苷存對大鼠存在一定的亞慢性毒性作用[22]，因此三七總皂苷口服的安全性問題尚存爭議[23-26]。三七醇提物中，含有多種化學物質，如三七總皂苷、總黃酮、總酚及多糖，發揮著多種藥理作用，并且在一定的劑量下呈現較好的量-效關系，未表現出毒性。充分反映了中藥的多成分、多靶點和整體性治療特色[27]。但三七降脂的活性物質基礎及其降脂作用尚待進一步闡明，尤其是可能存在的脂肪穩態調控的作用機制尚待深入研究。